張敏娜,羅聲棟，胡　燕，貌盼勇△

(中國(guó)人民解放軍第三○二醫(yī)院:1.感染性疾病診療與研究中心；2.臨床研究管理中心，北京 100039)

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·論著·

人上皮細(xì)胞黏附分子的真核表達(dá)及鑒定

張敏娜1,羅聲棟2，胡燕2，貌盼勇2△

(中國(guó)人民解放軍第三○二醫(yī)院:1.感染性疾病診療與研究中心；2.臨床研究管理中心，北京 100039)

摘要:目的構(gòu)建人上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)全基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，研究其在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)。方法將EpCAM 基因克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-EpCAM，轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2細(xì)胞。通過(guò)免疫熒光、Western Blotting及流式細(xì)胞檢測(cè)對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)EpCAM蛋白的表達(dá)進(jìn)行鑒定。結(jié)果雙酶切鑒定結(jié)果表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。免疫熒光、Western Blotting及流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果一致表明，轉(zhuǎn)染后EpCAM基因在HepG2細(xì)胞中表達(dá)成功。結(jié)論成功構(gòu)建了人EpCAM 的真核表達(dá)載體，并在HepG2細(xì)胞中表達(dá)，為研究高表達(dá)人EpCAM的肝癌細(xì)胞的功能打下基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:人上皮細(xì)胞黏附分子；真核表達(dá)；載體

人上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM) 是最早在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)的一種跨膜糖蛋白，也是第一個(gè)用單克隆抗體技術(shù)鑒定出來(lái)的人腫瘤相關(guān)抗原[1]。EpCAM 廣泛表達(dá)于上皮來(lái)源的正常組織[2]，并在多種上皮源性癌組織中不同程度的過(guò)表達(dá)[3]。已被多項(xiàng)研究證實(shí)與腫瘤的診斷和預(yù)后密切相關(guān)。在肝細(xì)胞癌中，雖然EpCAM 表達(dá)率較低，但由于近年來(lái)的研究認(rèn)為EpCAM 為肝癌干細(xì)胞標(biāo)記，而受到越來(lái)越多的關(guān)注[4]。本研究對(duì)人肝細(xì)胞癌組織來(lái)源的EpCAM 全基因序列在肝癌細(xì)胞系中進(jìn)行了真核表達(dá)研究，為探討高表達(dá)EpCAM的肝癌細(xì)胞功能打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料EpCAM RNA 由本院行肝癌切除術(shù)患者的肝癌組織中提取。HepG2細(xì)胞由醫(yī)院臨床研究管理中心保存。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(SuperScriptⅢ Reverse Transcriptase)、轉(zhuǎn)染試劑盒(LipofectamineTM2000)、RIPA裂解液均購(gòu)自Invitrogen公司。DNA片段純化試劑盒(EasyPure Quick Gel Extration Kit)、Anti-his 鼠單克隆抗體、 FITC標(biāo)記羊抗鼠-IgG抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG 抗體、Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)于全式金公司。鼠抗人EpCAM單克隆抗體MOC-31(EpCAM細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域抗體)購(gòu)自AbD Serotec 公司，兔抗人Ep-ICD單克隆抗體(EpCAM細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域抗體)購(gòu)自Abcam 公司，anti-EpCAM-PE抗體購(gòu)自BD公司。限制性核酸內(nèi)切酶KpnⅠ、XbaⅠ購(gòu)自NEB公司。質(zhì)粒中量提取試劑盒購(gòu)自Qiagen 公司。

1.2引物合成根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中提交的EpCAM基因序列(ID：DQ891338)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，對(duì)EpCAM 全基因序列進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。外引物正向序列5′-3′：TCC CGC GCC CCT CTT CTC，反向序列5′-3′：ATT TGC TAT TTC CCT TCT TCT，用于第1輪PCR擴(kuò)增。內(nèi)引物正向序列5′-3′：GGT ACC ATG TAC CCA TAC GAC GTC CCA GAC TAC GCT GCG CCC CCG CAG GTC CT，添加KpnⅠ酶切位點(diǎn)及HA-tag序列，反向序列5′-3′：TCT AGA TTA ATG GTG ATG GTG ATG ATG TGC ATT GAG TTC CCT AT，添加 XbaⅠ酶切位點(diǎn)及His-tag序列，用于第2輪PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)計(jì)大小為1 002 bp，按照pcDNA3.1(+) 載體進(jìn)行翻譯，可用His-tag及HA-tag抗體進(jìn)行蛋白表達(dá)鑒定。

1.3EpCAM基因的擴(kuò)增將肝癌組織提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū))。以EpCAM cDNA為模板,用合成的內(nèi)、外兩對(duì)引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。第一輪擴(kuò)增反應(yīng)體系：5×TransStart FastPu DNA聚合酶緩沖液 10 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，上游外引物2 μL，下游外引物2 μL，5×TransStart FastPu DNA聚合酶1 μL，EpCAM cDNA 1 μL，dH2O 30 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min。第2輪擴(kuò)增反應(yīng)體系：5×TransStart FastPu DNA聚合酶緩沖液10 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，上游內(nèi)引物2 μL，下游內(nèi)引物2 μL，5×TransStart FastPu DNA聚合酶 1 μL，第1輪PCR產(chǎn)物 1 μL，dH2O 30 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，擴(kuò)增2個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，擴(kuò)增2個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，擴(kuò)增22個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min。將瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確的EpCAM基因序列連接到平末端載體pEASY-Blunt Simple，轉(zhuǎn)化至Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)增培養(yǎng)單克隆菌落并提取質(zhì)粒。PCR及酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送Sangon Biotech公司測(cè)序。

1.4EpCAM真核表達(dá)載體的構(gòu)建用限制性核酸內(nèi)切酶KpnⅠ和XbaⅠ同時(shí)酶切測(cè)序正確的重組質(zhì)粒及真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，膠回收純化目的片段。連接反應(yīng)體系：10×T4 DNA連接酶緩沖液 10 mmol/LATP 1 μL，pcDNA3.1(+)酶切片段 1 μL，重組質(zhì)粒酶切片段7 μL，T4 DNA連接酶1 μL。連接反應(yīng)條件：25 ℃連接反應(yīng)1 h，16 ℃過(guò)夜。轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)增培養(yǎng)單克隆菌落并提取質(zhì)粒，將酶切鑒定及測(cè)序均正確的重組質(zhì)粒命名為pcDNA3.1(+)-EpCAM。中提質(zhì)粒，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)質(zhì)粒的濃度，備轉(zhuǎn)染用。

1.5重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-EpCAM轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞HepG2細(xì)胞用含有10%胎牛血清、1% 非必需氨基酸及雙抗(鏈霉素+青霉素)的DMEM 培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于六孔板，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)密度達(dá)70%～80%時(shí)，換無(wú)抗菌藥物培養(yǎng)液。按照質(zhì)粒質(zhì)量與轉(zhuǎn)染試劑體積2∶5的比例對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用Opti-MEM (每孔250 μL)稀釋轉(zhuǎn)染試劑(每孔10 μL)，混勻后靜置5 min；Opti-MEM(每孔250 μL)稀釋質(zhì)粒(每孔4 μg)；轉(zhuǎn)染試劑稀釋液與質(zhì)粒稀釋液混勻后靜置20 min后加入六孔板培養(yǎng)液中。于37 ℃培養(yǎng)6 h后更換為含抗菌藥物的DMEM 全培養(yǎng)液，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6間接免疫熒光轉(zhuǎn)染前1 d于六孔板中放入無(wú)菌蓋玻片,將胰酶消化的HepG2細(xì)胞鋪于六孔板。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-EpCAM質(zhì)粒的HepG2 細(xì)胞繼續(xù)于37 ℃孵育24～48 h，至細(xì)胞長(zhǎng)至單層密度約90%，將細(xì)胞玻片取出，PBS洗片，冷丙酮固定，晾干。取制備好的細(xì)胞片置于載玻片上，放置于黑色濕盒內(nèi)，PBS洗片；擬行抗-EpICD染色的細(xì)胞片加0.1% Trixon 100 破膜處理5 min，PBS洗片；加5%牛血清白蛋白封閉30 min；分別加一抗：抗-his鼠單克隆抗體(濃度1∶200)或鼠抗人EpCAM單克隆抗體MOC-31(濃度1∶200)或兔抗人抗-EpICD抗體(濃度1∶200)，4 ℃孵育過(guò)夜；洗片后加FITC標(biāo)記山羊抗鼠單抗(濃度1∶200)、伊文藍(lán)襯染胞核，濕盒內(nèi)室溫避光孵育40 min；PBS洗片后用10%甘油封片。于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.7Western Blotting檢測(cè)EpCAM真核表達(dá)蛋白收集轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-EpCAM質(zhì)粒24及48 h后的HepG2細(xì)胞，用RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞，加入蛋白上樣液，煮沸5 min，12 000 g 離心5 min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳；轉(zhuǎn)膜及脫脂牛奶封閉后，加兔抗人抗-EpICD抗體(濃度1∶5 000)，4 ℃孵育過(guò)夜。用PBST洗膜，加HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(濃度1∶3 000)，室溫孵育1 h，PBST洗膜后顯影成像。

1.8流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2細(xì)胞EpCAM表達(dá)率收集轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-EpCAM質(zhì)粒48 h的HepG2細(xì)胞；PBS洗細(xì)胞2次；100 μL PBS重懸后加入抗-EpCAM-PE抗體，室溫避光染色20 min；PBS洗細(xì)胞2次；用200 μLPBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2結(jié)果

2.1EpCAM基因擴(kuò)增電泳結(jié)果經(jīng)巢式PCR 擴(kuò)增后，1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示1條約1 000 bp 的DNA片段，與預(yù)計(jì)條帶大小相符，見(jiàn)圖1。測(cè)序分析后與Genbank中EpCAM基因(ID：DQ891338)ORF 序列比對(duì)，完全一致，表明EpCAM 基因擴(kuò)增成功。

泳道1：Trans2K Plus Ⅱ DNA標(biāo)記物；泳道2：EpCAM 基因擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖1EpCAM 基因的擴(kuò)增

2.2EpCAM真核表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果用KpnⅠ和XbaⅠ酶切重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-EpCAM，電泳結(jié)果顯示大小約5.4 kbp和1 000 bp的兩條DNA條帶,其中5.4 kbp的條帶為載體pcDNA3.1(+)，1 000 bp的條帶為插入的EpCAM基因,均與預(yù)計(jì)大小相符,表明EpCAM基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功,酶切電泳圖見(jiàn)圖2。

泳道1：Trans2K Plus Ⅱ DNA標(biāo)記物；泳道2：EpCAM重組質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物。

圖2重組真核表達(dá)質(zhì)粒的酶切分析

2.3pcDNA3.1(+)-EpCAM質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果 熒光顯微鏡下觀察到成功轉(zhuǎn)染入pcDNA3.1(+)-EpCAM質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞，經(jīng)EpCAM胞外域抗體(MOC-31)、胞內(nèi)域抗體(抗-EpICD)、抗-His抗體染色均可于胞漿見(jiàn)翠綠色熒光。對(duì)照組HepG2細(xì)胞呈暗紅色，未見(jiàn)熒光。見(jiàn)圖3(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)。

2.4Western Blotting檢測(cè)EpCAM表達(dá)的結(jié)果pcDNA3.1(+)-EpCAM質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞的蛋白提取物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，Western Blotting結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒24 h及48 h后的細(xì)胞蛋白樣品均在約40×103處出現(xiàn)目的條帶，提示EpCAM融合蛋白的成功表達(dá)，并驗(yàn)證了所表達(dá)蛋白的抗原活性。如圖4所示。

1.EpCAM蛋白陽(yáng)性對(duì)照(EpCAM原核表達(dá)融合蛋白)；2.轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-EpCAM質(zhì)粒24 h后的蛋白樣品；3.轉(zhuǎn)染48 h后；4.陰性對(duì)照(HepG2細(xì)胞蛋白樣品)。

圖4Western Blotting分析EpCAM真核表達(dá)

蛋白的特異性

2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2細(xì)胞EpCAM陽(yáng)性率的結(jié)果未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞EpCAM陽(yáng)性細(xì)胞率0.6%，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-EpCAM重組質(zhì)粒后EpCAM陽(yáng)性細(xì)胞率升高到20.2%。見(jiàn)圖5(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)。

3討論

EpCAM為Ⅰ型跨膜糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約為40×103，由314個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子結(jié)構(gòu)包括：細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(EpEX)、單次跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(EpICD)。EpCAM 可介導(dǎo)非Ca2+依賴性同源細(xì)胞間的黏附，促進(jìn)細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖[5]，并與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、侵襲及轉(zhuǎn)移等相關(guān)[6]。近年來(lái)，EpCAM被多項(xiàng)研究證實(shí)為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記。由于EpCAM 是目前表達(dá)最強(qiáng)和最廣泛的腫瘤抗原之一,可能成為大多數(shù)上皮源性腫瘤免疫治療的靶點(diǎn)。目前，EpCAM 抗體對(duì)于結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等的治療主要還處于臨床試驗(yàn)階段。已經(jīng)在德國(guó)上市的鼠來(lái)源抗EpCAM 單克隆抗體Edrecolomab(ED) 是第一個(gè)用于治療人類(lèi)胃腸道腫瘤并顯示出延長(zhǎng)整體生存期的臨床療效的單克隆抗體[7-8]。EpCAM 雙特異性抗體Catumaxomab 也于2009年被歐盟委員會(huì)批準(zhǔn)應(yīng)用于EpCAM 表達(dá)陽(yáng)性腫瘤患者的惡性腹水的治療，并顯示出僅次于上皮癌的明確的臨床獲益[9]。在肝細(xì)胞癌方面，近年研究認(rèn)為EpCAM 為肝癌干細(xì)胞標(biāo)記物，EpCAM表達(dá)陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞也同時(shí)表達(dá)其他肝干細(xì)胞標(biāo)記，具備自我更新和分化能力及較高的侵襲性,能夠在NOD/SCID 小鼠(非肥胖糖尿病嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠)中誘生高侵襲性的肝癌[10]。但對(duì)于EpCAM在肝癌中的作用機(jī)制及未來(lái)可能的診療方面的應(yīng)用還有待于進(jìn)一步研究。本研究為最大程度地模擬表達(dá)EpCAM的肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，選擇HepG2細(xì)胞系作為EpCAM的真核表達(dá)細(xì)胞。前期流式細(xì)胞儀及細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)均顯示其EpCAM天然表達(dá)率很低。HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染EpCAM真核表達(dá)重組質(zhì)粒后，應(yīng)用EpCAM特異性胞外域、胞內(nèi)域抗體及抗-His標(biāo)簽抗體行免疫熒光檢測(cè)，均觀察到表達(dá)EpCAM蛋白的細(xì)胞胞漿翠綠色熒光染色；Western Blotting分析顯示轉(zhuǎn)染真核表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞蛋白樣品呈現(xiàn)EpCAM的特異性條帶；流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞EpCAM陽(yáng)性率顯著升高。以上結(jié)果均表明EpCAM重組質(zhì)粒真核表達(dá)成功，與原核表達(dá)系統(tǒng)相比，真核表達(dá)產(chǎn)物更接近于天然分子的構(gòu)象，為研究EpCAM表達(dá)陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]Herlyn M,Steplewski Z,Herlyn D,et al.Colorectal carcinoma-specific antigen:detection by means of monoclonal antibodies[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1979,76(3):1438-1442.

[2]Winter MJ,Nagtegaal ID,Van Krieken JH,et al.The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology[J].Am J Pathol,2003,163(6):2139-2148.

[3]Went PT,Lugli A,Meier S.et al.Frequent EpCAM protein expression in human carcinomas[J].Hum Pathol,2004,35(1),122-128.

[4]Gires O,Klein CA,Baeuerle PA.On the abundance of EpCAM on cancer stem cells[J].Nat Rev Cancer，2009,9(2):143.

[5]Münz M,Kieu C,Mack B,et al.The carcinoma-associated antigen EpCAM upregulates c-myc and induces cell proliferation[J].Oncogene,2004,23(34):5748-5758.

[6]Balzar M,Winter MJ,de Boer CJ,et al.The biology of the 17-1A antigen (EpCAM)[J].J Mol Med,1999,77(10):699-712.

[7]Sears HF,Atkinson B,Mattis J,et al.Phase-Ⅰ clinical trial of monoclonal antibody in treatment of gastrointestinal tumours[J].Lancet,1982,1(8275):762-765.

[8]Riethmüller G,Schneider-G?dicke E,Schlimok G,et al.Randomised trial of monoclonal antibody for adjuvant therapy of resected Dukes′ C colorectal carcinoma[J].Lancet,1994,343(8907):1177-1183.

[9]Heiss MM,Murawa P,Koralewski P,et al.The trifunctional antibody catumaxomab for the treatment of malignant ascites due to epithelial cancer:results of a prospective randomized phase Ⅱ/Ⅲ trial[J].Int J Cancer,2010,127(9):2209-2221.

[10]Yamashita T,Ji J,Budhu A,et al.EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features[J].Gastroenterology,2009,136(3):1012-1024.

Expression and identification of human EpCAM eukaryotic recombinant plasmid

ZhangMinna1,LuoShengdong2,HuYan2,MaoPanyong2△

(1.TreatmentandResearchCenterforInfectiousDiseases;2.ResearchCenterforClinicalMedicine,the302HospitalofPLA,Beijing100039,China)

Abstract:ObjectiveTo construct human EpCAM eukaryotic recombinant plasmid,and to study the expression of EpCAM protein in HepG2 cells.MethodsThe recombinant plasmid,named pcDNA3.1(+)-EpCAMwas constructed by cloning EpCAM gene into eukaryotic vector pcDNA3.1(+).Then HepG2 cells were transfected with EpCAMrecombinant plasmid.The eukaryotic expression of EpCAM protein was verified by immunofluorescence，Western Blotting and flow cytometry.ResultsThe construction of EpCAM recombinant eukaryotic plasmid was identified by restriction enzyme digestion.The results of immunofluorescence,Western Blotting,and flow cytometry consistently indicated that EpCAM protein were successfully expressed in HepG2 cells.ConclusionHuman EpCAM eukaryotic vector is constructed and EpCAM protein could be expressed well in HepG2 cells,which laid a foundation for further research on the function ofhepatocarcinoma cells highly expressing EpCAM.

Key words:epithelia cell adhesion molecule;eukaryotic expression;vector

(收稿日期：2016-01-02)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.09.028

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)09-1223-03

作者簡(jiǎn)介：張敏娜，女，主治醫(yī)師，主要從事感染性疾病診療研究?！魍ㄓ嵶髡撸珽-mail:maopy302@163.com。