黃小瓊, 黃 威, 朱穎欣, 劉月姝, 黃小紅, 樓彩霞, 鄺少松, 黃淑堅

(1. 廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心, 佛山 528248; 2. 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 佛山 528248）

歸腎丸對免疫性卵巢早衰小鼠白細胞介素-17 和白細胞介素-1β 水平的影響

黃小瓊1, 黃 威1, 朱穎欣1, 劉月姝1, 黃小紅1, 樓彩霞1, 鄺少松1, 黃淑堅2

(1. 廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心, 佛山 528248; 2. 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 佛山 528248）

目的 探討歸腎丸對免疫性卵巢早衰(POF)小鼠血清白細胞介素-17(IL-17)和白介素-1β (IL-1β)水平的影響。方法 采用小鼠透明帶多肽抗原免疫小鼠，建立免疫性(POF)小鼠模型。歸腎丸灌胃干預(yù)4周，取小鼠血清用ELISA法檢測IL-17; 取卵巢組織，行HE染色，觀察卵泡形態(tài);用免疫組織化學(xué)方法檢測卵巢IL-1β。結(jié)果 與模型組比較, 正常對照組、戊酸雌二醇組(陽性對照)、歸腎丸高、中和低劑量組小鼠卵母細胞內(nèi)卵泡液IL-1β平均吸光度值均有顯著減少(P＜0.01);正常對照組和戊酸雌二醇組血清IL-17有顯著減少(P＜0.01)，高、中和低劑量組血清IL-17有顯著減少(P＜0.05)。與正常對照組比較，模型組卵母細胞內(nèi)卵泡液IL-1β平均吸光度值呈顯著增加(P＜0.01)，其他各組均無顯著差異(P＞0.05); 模型組、戊酸雌二醇組、高劑量組、中劑量組和低劑量組顆粒細胞內(nèi)卵泡液IL-1β平均光密度值均無顯著性差異(P＞0.05); 模型組、戊酸雌二醇組、高劑量組、中劑量組和低劑量組血清IL-17均呈顯著性增加(P＜0.01)。結(jié)論 歸腎丸可能通過調(diào)節(jié)IL-1β和IL-17改善小鼠自身免疫紊亂，從而改善卵巢卵泡功能。

歸腎丸; 自身免疫性卵巢早衰(POF); 白細胞介素-17(IL-17); 白細胞介素-1β(IL-1β)

40歲前的婦女出現(xiàn)閉經(jīng)、促性腺激素水平升高、雌激素缺乏等癥狀，臨床上稱為卵巢早衰(premature ovarian failure, POF), 其發(fā)病率在1%～3%, 近年來有升高的趨勢。該病發(fā)病機制目前尚未闡明, 是婦科和生殖醫(yī)學(xué)研究的難點之一[1～3]。激素治療雖然可以改善癥狀，但易引起癌變并具有毒副作用，所以諸多學(xué)者開始尋求采用中藥治療的方法。有文獻[4]報道用歸腎丸可治療POF、月經(jīng)過少等疾病。目前研究[5]表明 POF與自身免疫紊亂密切相關(guān)，細胞因子在對生殖生理的調(diào)控中，不僅能影響卵巢激素分秘、卵泡形成和孕卵著床，還參與子宮內(nèi)膜的重建修復(fù)等過程；作為免疫與內(nèi)分泌系統(tǒng)的一個重要連接因子，細胞因子在女性生殖生理及卵巢激素調(diào)節(jié)、卵巢排卵中均起著重要作用。本實驗通過探討歸腎丸對POF的免疫作用機制，試圖為研究歸腎丸治療POF藥效提供理論基礎(chǔ)和疾病診斷標(biāo)準。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雌性BALB/c小鼠70只, 18～22 g, 由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供[SCXK(粵)2013-0002]。飼養(yǎng)于屏障設(shè)施[SYXK(粵)2013-0002]。動物實驗經(jīng)中心實驗動物倫理委員會審查批準。

1.2 實驗藥物和儀器試劑

歸腎丸湯劑為自制水提物，主要中藥成分為菟絲子、黃芪、黨參、枸杞子、杜仲、淫羊藿、女貞子、柴胡、丹參、炙甘草。歸腎丸臨床擬用量為每日2.55 g/kg，設(shè)中劑量組為小鼠等效劑量(臨床用量的10倍), 即每日25.5 g/kg; 高劑量為臨床用量的20倍，即每日51 g/kg; 低劑量為臨床用量的5倍，即每日12.75 g/kg。按配方比例取153 g中藥加1 530 mL的水煎煮，燒開后慢火煎煮1 h，倒出藥液。藥渣再加1 530 mL水煎煮，燒開后慢火煎煮1 h，倒出藥液。合并兩次煎煮藥液，濃縮至60 mL，獲得濃度為2.55 g/mL的歸腎丸中藥,用于高劑量組給藥; 小鼠透明帶多肽抗原: 批號，CO-06-02823, 中肽生化有限公司; 戊酸雌二醇片: 批號: 081A2, 拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司。主要儀器、試劑: BX41型熒光顯微鏡: 日本Olympus; DG5033A型酶標(biāo)儀: 南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司; RM2235型輪轉(zhuǎn)切片機: Leica@，德國; BX43型生物顯微鏡: Olympus@CellSensStandard顯微圖像軟件: Olympus@，日本; HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng): 武漢千屏影像技術(shù)有限責(zé)任公司; 白細胞介素17(IL-17)酶聯(lián)免疫試劑盒: 批號: N03019729，武漢華美生物工程有限公司; 抗白細胞介素-1β(IL-1β)抗體: 批號: GR1134-40，Abcam公司; 兔IgG試劑盒: 批號: 10L03A, 博士德生物技術(shù)有限公司; DAB顯色試劑盒: 博士德生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

小鼠按完全隨機法分為正常對照組10只，造模組60只，正常對照組注射生理鹽水，造模組按文獻方法[6]造模, 造模成功后, 按體質(zhì)量隨機區(qū)組法,分為5組, 模型組、戊酸雌二醇組(0.3 mg/kg, 陽性對照)、歸腎丸高、中、低劑量組, 每組12只。模型組不作處理，戊酸雌二醇組、高、中、低劑量組均于第3次免疫后給藥，各劑量組灌胃給予歸腎丸湯劑，0.2 mL/10 g，共灌胃4周。灌胃結(jié)束后采全血，3 000 r/min離心，分離血清，ELISA法檢測血清IL-17; 取血后，立即頸椎脫臼法處死小鼠，取小鼠卵巢用質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛固定，HE染色，觀察卵泡形態(tài); 免疫組織化學(xué)法檢測卵巢細胞因子IL-1β。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以x-±s表示，單因素方差分析進行模型組與各給藥組間差異的顯著性檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對卵泡形態(tài)的影響

光鏡下觀察小鼠卵巢各級卵泡形態(tài)見圖1。正常對照組小鼠卵巢色澤紅潤，成熟卵泡顆粒細胞層次多，卵泡液很豐富(圖1A)。模型組小鼠卵巢內(nèi)見多量閉鎖卵泡，卵母細胞固縮，卵泡的顆粒細胞排列極紊亂(圖1B)。戊酸雌二醇組成熟卵泡的顆粒細胞排列稍紊亂，有少量的閉鎖卵泡(圖1C)。高劑量組可見成熟卵泡，卵泡液很豐富，顆粒細胞排列規(guī)則，層次多。(圖1D)。中劑量組卵泡顆粒細胞層次較多，排列稍紊亂，卵泡液豐富，也可見少量閉鎖卵泡(圖1E)。低劑量組成熟卵泡的顆粒細胞排列稍紊亂，仍有較多的閉鎖卵泡(圖1F)。

2.2 對卵巢IL-1β和血清IL-17的影響

結(jié)果表明(表1)，與模型組比較，各組卵母細胞內(nèi)卵泡液IL-1β吸光度值顯著減少(P＜0.01)，而顆粒細胞卵泡液內(nèi)IL-1β吸光度值均無顯著性差異(P＞0.05); 與模型組比較，各組血清IL-17有顯著性減少(P＜0.01或P＜0.05)。與正常對照組比較，模型組卵母細胞內(nèi)卵泡液IL-1β吸光度值顯著增加(P＜0.01)，其他各組均無顯著性差異(P＞0.05); 各組IL-17均顯著增加(P＜0.01)。

3 討論

POF的免疫紊亂表現(xiàn)在卵巢的組織學(xué)及各種自身抗體、細胞因子、免疫蛋白、T 淋巴細胞亞群的變化等幾個方面。以往的研究表明[7]，免疫性卵巢早衰患者表現(xiàn)為Th17細胞的過度激活和Treg細胞過度減少。Th17細胞是表達IL-17的CD4+T細胞，通常認為IL-17是眾多促炎因子之一, IL-17介導(dǎo)了炎癥反應(yīng)，使機體受到損傷。有文獻[8]報道，卵巢早衰小鼠IL-17、IL-6明顯增高, 可以作為卵巢早衰小鼠免疫損傷度的檢測指標(biāo)。本實驗結(jié)果表明: 與模型組比較，正常對照組和戊酸雌二醇組血清IL-17有顯著性減少(P＜0.01)，高劑量組、中劑量組和低劑量組血清IL-17有顯著性減少(P＜0.05)。

圖1 歸腎丸對免疫性卵巢早衰小鼠卵泡形態(tài)的影響(HE× 400)

表1 歸腎丸對免疫性卵巢早衰小鼠卵巢IL-1β和血清IL-17的影響 ng/L

正常生理情況下，卵泡刺激素(FSH)促進血單核細胞分泌IL-Iβ，誘導(dǎo)卵細胞成熟，黃體生成激素(LH)則促進IL-Iβ在人黃素化顆粒細胞上的轉(zhuǎn)錄表達, 調(diào)節(jié)卵巢表面類固醇的生成，參與卵泡生長發(fā)育過程。IL-1β有較強的抗促性腺激素作用, 可阻斷顆粒細胞分泌孕酮(P) 和形成LH 受體, 并通過抑制雌激素、P、雄激素和LH 受體的形成, 阻止卵泡閉鎖。當(dāng)體內(nèi)出現(xiàn)免疫紊亂，表現(xiàn)為IL-1β過度增強或下降時，卵泡的發(fā)育及閉鎖受到影響，分泌雌、孕激素下降，出現(xiàn)排卵障礙，卵泡閉鎖加速, 而卵泡閉鎖的加速是POF 的發(fā)病原因之一。

Karagouni等[10]報道，采用ELISA方法檢測血清和卵泡液IL-1β, 顯示卵泡液中IL-1β的水平明顯增高，提示 IL-1β主要表達在卵巢。路帥[11]報道,排卵障礙模型大鼠卵巢組織中IL-1β、TNF-α、TGF-β1及 TGF-βR1蛋白的水平較正常組均顯著升高，提示它們與卵巢排卵功能密切相關(guān)。本實驗結(jié)果表明: 模型組小鼠卵巢內(nèi)見大量閉鎖卵泡，卵母細胞固縮, 生長卵泡和成熟卵泡極少, 卵泡的顆粒細胞排列極紊亂，提示本實驗采用小鼠多肽抗原成功建立了POF模型。與模型組比較，對照組、戊酸雌二醇組、歸腎丸高、中和低劑量組卵母細胞內(nèi)卵泡液IL-1β平均吸光度值顯著性減少(P＜0.01);而陰性對照組、戊酸雌二醇組、歸腎丸高、中和低劑量組顆粒細胞卵泡液內(nèi)IL-1β平均光密度值均無顯著性差異(P＞0.05)，提示免疫性POF小鼠可能出現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)紊亂，IL-1β主要在卵巢的卵母細胞液有高表達, 歸腎丸可能通過調(diào)節(jié)IL-1β和IL-17改善自身免疫紊亂。

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R285.5 Q95-33

B

1674-5817(2016)05-0387-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.05.013

2016-05-22

廣東省中醫(yī)藥管理局課題(20132105), 廣東省科技計劃項目(2012B050500006)

黃小瓊(1973-), 女, 高級獸醫(yī)師, 從事實驗動物和

比較醫(yī)學(xué)研究工作。E-mail: 842576040@qq.com. [通訊作者] 黃淑堅(1966-), 男, 教授, 動物傳染病診斷和防治。

E-mail: 617955368@qq.com.

鄺少松(1973-), 女, 高級獸醫(yī)師, 從事實驗動物和比較醫(yī)學(xué)研究工作。E-mail: 793053642@qq.com