高 原, 劉丁龍, 徐 平, 虎 力, 張偉波, 溫珮彤

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院, 上海201203; 2. 甘肅省人民醫(yī)院傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)診療中心, 蘭州 730000)

介紹一種簡易“X”型大鼠固定法的使用

高 原1, 劉丁龍2, 徐 平1, 虎 力1, 張偉波1, 溫珮彤1

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院, 上海201203; 2. 甘肅省人民醫(yī)院傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)診療中心, 蘭州 730000)

目的 探討一種可適用于實(shí)驗大鼠且能進(jìn)行較長時間固定的簡易方法，為大鼠進(jìn)行針刺或電針操作提供技術(shù)支持。方法 以110～120 cm長的棉線繩2根、6 cm寬口徑的透明膠帶、20 cm長1 cm寬的絲帶為材料，參照骨科鎖骨骨折的固定方法，對大鼠進(jìn)行“X”型固定操作。結(jié)果 采用“X”型固定法后，在較短的時間內(nèi)大鼠得到了有效的固定，從而極大提高了實(shí)驗效率。結(jié)論 “X”型固定法是一種簡易、經(jīng)濟(jì)、高效且較為安全的大鼠固定方法，便于長時間留針或電針干預(yù)，可在大鼠實(shí)驗中廣泛推廣。

大鼠; “X”型固定方法; 針刺

大鼠是常用的實(shí)驗動物, 已廣泛應(yīng)用于中醫(yī)中藥研究領(lǐng)域[1]。由于大鼠生性好動，故在針刺實(shí)驗中，能夠使其較長時間安靜地接受針刺干預(yù)并不理想, 而實(shí)施電針等較強(qiáng)刺激的干預(yù)措施則更為困難。目前眾多學(xué)者報道了涉及針刺的大鼠固定方法[1-5]，然而在實(shí)際使用中存在諸多不足。作者在長期動物實(shí)驗研究中參照骨科鎖骨骨折的固定方法，探索出了一種“X”型固定法，該方法能夠穩(wěn)定、高效地限制大鼠自由活動能力，使長時間進(jìn)行針刺或電針治療成為可能，現(xiàn)介紹如下:

1 “X”型固定方法

1.1 實(shí)驗動物與材料

SPF級雌性SD大鼠60只, 由上海西普爾-必凱實(shí)驗動物有限公司提供[SCXK(滬)2013-0016]，于6月齡時購進(jìn)，體質(zhì)量280～320 g，在其12月齡時開始實(shí)驗，直到18月齡，實(shí)驗期間體質(zhì)量550～800 g; 110～120 cm棉線繩2根; 口徑6 cm的透明膠帶; 20 cm長1 cm寬的絲帶1根; 華佗牌0.30 mm ×13 mm一次性針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠); G6805-1電針治療儀(青島鑫升實(shí)業(yè)有限公司)。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物設(shè)施[SYXK(滬)2014-0008]。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 固定四肢 固定雙前肢時，用一只手將大鼠從背部抓起，另一只手用將一根棉線從大鼠一側(cè)肩后開始，依次經(jīng)同側(cè)腋下，繞過肩關(guān)節(jié)，從同側(cè)肩關(guān)節(jié)前方，橫過背部，交叉到另一側(cè)肩關(guān)節(jié)后方; 再從肩后經(jīng)腋下，繞過肩關(guān)節(jié)，從肩前上方，繞回背部，此為1個“X”，交叉后繼續(xù)在大鼠雙肩關(guān)節(jié)背側(cè)包繞“X”字，反復(fù)包繞5～8圈，最后將棉線的兩個繩頭，打個活結(jié)，系在背部正中上方即可。大鼠雙后肢依上法，在雙髖關(guān)節(jié)背側(cè)之間進(jìn)行“X”型固定。

1.2.2 固定尾部 將大鼠尾部卷成“U”型，平放于實(shí)驗臺上，用寬透明膠帶將鼠尾粘在臺上。

1.2.3 固定頭部 將1 cm寬的絲帶中點(diǎn)放在大鼠后項部，絲帶兩頭從肩后，經(jīng)腋下，穿行至肩前，用透明膠帶在肩前并行粘在實(shí)驗臺上。

1.3 針刺方法

參照《實(shí)驗針灸學(xué)》[6]常用實(shí)驗動物穴位圖譜,分別選取雙側(cè)“后三里”(脛骨前嵴外5 mm和下5 mm的交界處)和雙側(cè)“腎俞穴”(第2腰椎旁開7 mm); 采用華佗牌0.30 mm×13 mm一次性針灸針，直刺進(jìn)針后連接電針儀，頻率2/10 Hz疏密波，電流1～2 mA，持續(xù)15 min。

2 討論

2.1 實(shí)驗效果圖

實(shí)驗實(shí)際效果如圖1，圖2，圖3所示。

2.2 操作時間及固定時間

由于時間的局限, 故簡要對實(shí)驗早期(14月齡)、中期(16月齡)及末期(18月齡)抽取三個時間點(diǎn)測量其操作時間, 即固定一只大鼠所需時間, 以及15 min針刺過程中的穩(wěn)定率(表1、表2)。

2.3 統(tǒng)計結(jié)果對比

表1采用單因素方差分析，滿足正態(tài)齊性(p14=0.372，p16=0.796，p18=0.796)及方差齊性(Levene統(tǒng)計量=0.139, p=0.87＞0.05), 顯示三個時間點(diǎn)操作時間不完全相同, 兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 頭部固定

圖2 尾部固定

圖3 四肢固定

表1 三個時間點(diǎn)操作時間比較

3 討論

3.1 大鼠固定方法現(xiàn)狀

首先，筆者檢索了2001年1月至2015年7月國內(nèi)外有關(guān)大鼠固定與電針實(shí)驗方法的文獻(xiàn)，共計35篇，有價值的僅5篇；其次，查閱國家專利網(wǎng)有關(guān)針刺實(shí)驗大鼠固定的專利，發(fā)現(xiàn)大概可以分為三類：固定筒型[1-3,7-9]、固定板型[4,10-13]及二者結(jié)合型[14]，其中固定板型又可以分為固定四肢[11-13]以及利用大鼠恐高特性設(shè)計的高臺型[10]。最后，還搜索了一些生產(chǎn)廠家制作的大鼠固定器械成熟的產(chǎn)品，但這些器械大多都不是為大鼠針刺固定而專門設(shè)計的，一般不能用于針刺操作。

表2 大鼠針刺過程穩(wěn)定率

筆者在實(shí)驗過程中嘗試應(yīng)用了上述的幾種方法或器材，過程中存在以下問題: 大鼠可能出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)而持續(xù)掙扎, 直至實(shí)驗結(jié)束, 從而影響了實(shí)驗結(jié)果; 針刺穴位會隨著大鼠掙扎的體位、動作而改變,從而使皮毛、皮下組織的穴位不好把握; 實(shí)驗過程中容易出現(xiàn)掉針，掉針后令大鼠接受二次針刺，耽誤時間，影響針刺療效; 耗費(fèi)人力、耗費(fèi)時間;應(yīng)用乙醚等麻醉藥品后，才能進(jìn)行長時間電針針刺，但增加麻醉藥品因素干擾，獲得的實(shí)驗數(shù)據(jù)可能存在偏倚; 針刺強(qiáng)度、時間不能達(dá)到有效量。

因此，目前針刺實(shí)驗方面，固定大鼠器材或方法并未完全滿足實(shí)驗的要求。

3.2 本方法的優(yōu)點(diǎn)及不足之處

3.2.1 符合3R原則 “X”型固定方法總結(jié)了先前固定方法的優(yōu)點(diǎn), 在平時的實(shí)驗過程中, 發(fā)現(xiàn)它能優(yōu)化實(shí)驗方案, 規(guī)范實(shí)驗操作流程, 減少實(shí)驗動物的死亡，減少實(shí)驗過程中動物所受痛苦，減少動物實(shí)驗應(yīng)激反應(yīng), 較好的體現(xiàn)了減少(Reduction)、優(yōu)化(Refinement)和替代(Replacement)為核心的動物實(shí)驗替代方法的“3R”理論[15]。

3.2.2 簡單安全 實(shí)驗材料易得, 簡單易學(xué), 初學(xué)者很快即可掌握本方法操作要領(lǐng)，降低對實(shí)驗人員的操作要求，有效避免被大鼠咬傷。對于大鼠來說，僅限制了大鼠的四肢行動，使之呈較為舒適的俯伏位，棉線不經(jīng)過喉部，與四肢寬松接觸，不影響其正常呼吸及四肢供血。

目前有研究報道束縛法可以造成肝郁氣滯證型的大鼠模型[16,17]，仔細(xì)查閱相關(guān)文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)：這種束縛法固定時間均在2～3 h，遠(yuǎn)超過了針刺實(shí)驗要求的15～20 min的要求，并且大多都伴隨電、冷水等不良刺激，故二者有根本的區(qū)別。

3.2.3 取穴方便，減少實(shí)驗數(shù)據(jù)干擾因素 該方法使大鼠呈俯伏位，肢體舒展，能大范圍的暴露《實(shí)驗針灸學(xué)》中列出的大鼠常用的42個針刺穴位[6], 提高取穴、注射的準(zhǔn)確性; 尤其是四肢肘、膝關(guān)節(jié)的穴位更加突出, 研究者可以根據(jù)實(shí)驗需要，選取不同的腧穴; 不需麻醉, 刺激較小, 降低了大鼠應(yīng)激性反應(yīng)，排除了麻醉劑等非實(shí)驗因素的干擾，提高實(shí)驗結(jié)果的可靠性，確保了足夠的留針時間。3.2.4 固定效果好，提高實(shí)驗效率 結(jié)果提示，操作時間與穩(wěn)定率在不同月齡有所不同，操作時間保持在60 s左右, 針刺期間掉針在1次及以上者占少數(shù), 考慮實(shí)驗初期大鼠未完全適應(yīng)該方法的固定, 但隨著實(shí)驗進(jìn)行, 對于環(huán)境、實(shí)驗員以及固定方法的熟悉, 操作時間呈縮短趨勢, 穩(wěn)定率得到一定保證。

需要注意的一個竅門是: 固定時可將大鼠尾巴呈“U”字形固定于試驗臺，使其后肢不能發(fā)力，削弱了其保持平衡、加強(qiáng)后腿力量的作用，得到更好的固定效果。

4 小結(jié)

長期實(shí)踐表明，“X”型固定方法可以根據(jù)不同取穴需要選取大鼠不同部位，在長時間的留針針刺、電針的同時，使大鼠保持舒適的俯伏體位、保持自然呼吸、保證正常的四肢血液循環(huán)，達(dá)到足夠的針刺強(qiáng)度、針刺時間和針刺刺激累積量，是一種簡單、高效、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、較為安全的固定方法，可為實(shí)驗一線的研究人員提供一定的幫助和參考，具有廣泛的應(yīng)用價值。雖然本方法穩(wěn)定、可靠，但在實(shí)際操作過程中仍需注意切勿動作粗魯，忽視動物情緒，應(yīng)適當(dāng)?shù)匕矒釋?shí)驗動物，并以大鼠四肢活動受限，但不影響四肢血運(yùn)為度。此外，本方法尚處于前期探索階段，與其它方法的優(yōu)越性尚需進(jìn)一步系統(tǒng)、科學(xué)、隨機(jī)、對照的實(shí)驗數(shù)據(jù)來論證。

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An Introduction of Application of a Simple “X”Shaped Immobilization for Rats

GAO Yuan1, LIU Ding-long2, XU Ping1, HU Li1, ZHANG Wei-bo1, WEN Pei-tong1
(1. Acupuncture-Moxibustion and Tuina College, Shanghai University of TCM, Shanghai 201203, China; 2. Centre of Traditional Medicine of Diagnosis and Treatment, Gansu Provincial Hospital Lanzhou 730000, China)

ObjectiveTo introduce a simple and convenient method for relative long time immobilization for rats. This method can meet the requirements of acupuncture or electroacupuncture experiments on the rats.MethodsImitating the external immobilization for clavicular fracture in orthopedics, the rats were immobilized with two strips of cotton threads about 110～120 cm long, one roll of scotch tape about 6 cm wide and one strip of silk ribbon about 20 cm long and 1cm wide by “X” shaped immobilization. Result The rats are immobilized effectively within a short time and the efficiency of the experiment is improved greatly by means of “X” shaped immobilization.ConclusionThe simple, economical, effective and relatively safe method for immobilization the rats, “X” shaped immobilization is helpful to retain needle with the longer time and worth of popularizing.

Rats; “X”shaped immobilization; Acupuncture

Q95-33

A

1674-5817(2016)05-0378-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.05.011

2016-06-21

國家自然科學(xué)基金面上項目(81373755); 國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(81403470)

高 原(1988-), 男, 博士研究生, 方向: 針灸調(diào)控骨骼肌萎縮機(jī)制研究。E-mail: gaoacu@sina.com

徐 平, E-mail: xp99@163.com