袁水娟, 施國(guó)君, 唐慧青, 許文靜, 符 杰, 施美蓮

(1. 上海靈暢生物科技有限公司, 上海 201402; 2. 上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司, 上海 201615)

SCID Beige 與NOD.CB17-Prkdcscid 小鼠主要免疫指標(biāo)測(cè)定

袁水娟1, 施國(guó)君1, 唐慧青1, 許文靜1, 符 杰2, 施美蓮2

(1. 上海靈暢生物科技有限公司, 上海 201402; 2. 上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司, 上海 201615)

目的 測(cè)定SCID Beige (簡(jiǎn)稱SCID.BG)小鼠與NOD.CB17-Prkdcscid (簡(jiǎn)稱NOD.SCID)小鼠主要免疫球蛋白(Ig)、補(bǔ)體(C)、免疫細(xì)胞指標(biāo)，分析兩種免疫缺陷小鼠在免疫方面差異。方法選擇4周齡、8周齡、16周齡的SCID.BG小鼠、NOD.SCID小鼠各30只(雌雄各半)，測(cè)定主要免疫球蛋白、補(bǔ)體指標(biāo); 選擇8周齡的SCID.BG小鼠、NOD.SCID小鼠各14只(雌雄各半)，測(cè)定T細(xì)胞及亞群、B細(xì)胞、NK細(xì)胞免疫指標(biāo)。結(jié)果 3個(gè)年齡段的SCID.BG在IgG水平上顯著低于NOD.SCID，在IgA水平上顯著高于NOD.SCID; 4周齡、16周齡的SCID.BG在C4水平上顯著高于NOD.SCID; 8周齡 SCID.BG小鼠與NOD.SCID小鼠在IgG水平上均顯著低于其他兩個(gè)周齡; T細(xì)胞亞群中，8周齡 SCID.BG的CD4+CD8+百分比顯著低于NOD.SCID; SCID.BG小鼠與NOD.SCID小鼠同品系同周齡在性別上各項(xiàng)指標(biāo)均無顯著差異。結(jié)論 SCID.BG與NOD.SCID抗體、補(bǔ)體、免疫細(xì)胞水平含量均遠(yuǎn)低于正常小鼠的水平，同屬于T、B、NK重度免疫缺陷動(dòng)物，兩品系同周齡同性別比較各項(xiàng)免疫指標(biāo)各有高低，在實(shí)驗(yàn)中可以根據(jù)不同的研究目的選擇動(dòng)物。

SCID Beige (SCID.BG)小鼠; NOD.CB17-Prkdcscid (NOD.SCID)小鼠; 免疫球蛋白(Ig);補(bǔ)體 (C); 免疫細(xì)胞

自l987年Reddy等[1]首次在C.B-17 SCID小鼠體內(nèi)移植成功人類肺腺癌開始, 人惡性B細(xì)胞、原始淋巴瘤細(xì)胞、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、睪丸癌、卵巢癌等多種人類實(shí)體瘤成功移植于SCID等重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠, 為深入探索人類惡性腫瘤的發(fā)生機(jī)理、生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移規(guī)律及治療方法提供了良好的活體模型[2]。NOD.SCID小鼠是CB-17 SCID小鼠與NOD小鼠反交產(chǎn)生的, 該系小鼠既擁有CB-17 SCID小鼠缺乏適應(yīng)性免疫系統(tǒng)、不再發(fā)生自身免疫性非胰島素依賴性糖尿病的特征，同時(shí)又擁有NOD小鼠具備的多種固有免疫缺陷, 包括自然殺傷(NK)細(xì)胞活性低、骨髓功能發(fā)育不正常。相對(duì)于CB-17 SCID小鼠90%發(fā)生免疫滲漏, NOD.SCID小鼠僅有不到10%發(fā)生滲漏[3]。SCID.BG小鼠是1993年Mosier等[4]利用BALB/c.BG/BG同類近交系小鼠,將BG基因引入CB-17SCID小鼠后產(chǎn)生的，BG基因突變導(dǎo)致小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞活性降低。相對(duì)于NOD.SCID小鼠, SCID.BG免疫缺陷小鼠應(yīng)用尚不廣泛。有報(bào)道[5]用SCID.BG小鼠注射體外擴(kuò)增人類NK細(xì)胞，提示NK細(xì)胞制劑在治療人類惡性血液病試驗(yàn)中使用的可能性，也有報(bào)道[6]使用人類淋巴細(xì)胞移植于SCID.BG小鼠，無抗宿主反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)，可用于人類移植免疫研究。本文對(duì)SCID.BG小鼠與NOD.SCID小鼠進(jìn)行主要免疫指標(biāo)免疫球蛋白、補(bǔ)體、免疫細(xì)胞測(cè)定與比較。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來源

4周齡、8周齡、16周齡SPF級(jí)SCID.BG小鼠、NOD.SCID小鼠各30只(雌雄各半)，由上海靈暢生物科技有限公司提供 [SCXK(滬)2013-0018]。

1.2 環(huán)境及飼養(yǎng)管理

實(shí)驗(yàn)用小鼠飼養(yǎng)在上海靈暢生物科技有限公司隔離器中, 隔離器內(nèi)的空氣為100級(jí)全新風(fēng), 室內(nèi)溫度22～26 ℃, 相對(duì)濕度40%～60%, 換氣次數(shù)每小時(shí)20次, 光照明暗交替12 h∶12 h, 動(dòng)物自由飲食。

小鼠用飼料、墊料為上海普路騰生物科技有限公司提供[滬飼證(2014)04001], 經(jīng)35 kGy60Co輻照，飼料的營(yíng)養(yǎng)成分為：粗蛋白24.5%～25.5%，粗脂肪5.5%～6.5%，粗灰分6.0%～6.5%，粗纖維4.0%～4.5%, 水份≤10%，鈣1.2%～1.5%，磷0.75%～1.0%，賴氨酸≥1.32%，蛋氨酸+胱氨酸≥0.78%。飲用水為酸化過濾純水, pH值2.5～3.5,并經(jīng)121 ℃ 、40 min高壓蒸汽滅菌。墊料每周更換一次，進(jìn)出隔離器的物品均進(jìn)行121 ℃, 30 min消毒滅菌處理。

1.3 主要儀器

日本日立7020全自動(dòng)生化分析儀，德國(guó)eppendorf 5427R離心機(jī), 美國(guó)BD公司流式細(xì)胞儀。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物采血 質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%水合氯醛溶液按體質(zhì)量10 mL/kg腹腔注射麻醉，眼眶靜脈采血后脫頸椎處死。

1.4.2 血液生化相關(guān)免疫指標(biāo)測(cè)定 取0.8 mL全血于4 ℃冰箱放置1 h后以2 800×g離心10 min，分離出血清，用日立7020全自動(dòng)生化儀檢測(cè)免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)和補(bǔ)體(C3、C4)。

1.4.3 免疫細(xì)胞測(cè)定 動(dòng)物處死后取脾臟，盡量去除附著其上的脂肪組織，放入淋巴細(xì)胞分離液，研磨，將分離液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管內(nèi)，覆蓋200～500 μL的1640培養(yǎng)基, 800×g離心30 min, 吸出淋巴細(xì)胞層, 再加入10 mL 1640培養(yǎng)基, 250×g離心10 min收集細(xì)胞，傾倒上清液，流式細(xì)胞儀細(xì)胞計(jì)數(shù)，測(cè)定T細(xì)胞及亞群、B細(xì)胞(B220+)、NK細(xì)胞(NK1-1+)。

1.5 結(jié)果處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用軟件SPSS 17.0分析, 數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。 主要免疫球蛋白和補(bǔ)體指標(biāo)進(jìn)行LSD法單因素方差分析。主要免疫細(xì)胞采用非參數(shù)檢驗(yàn)分析, U檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 主要免疫球蛋白和補(bǔ)體指標(biāo)測(cè)定

兩品系同性別同周齡比較，各周齡SCID.BG在IgG水平上顯著低于NOD.SCID，在IgA水平上顯著高于NOD.SCID; 16周齡 SCID.BG在C3水平上顯著低于NOD.SCID; 4周齡、16周齡 SCID.BG在C4水平上顯著高于NOD.SCID(表1)。兩品系同品系同周齡不同性別比較均無顯著差異。同品系同性別不同周齡比較，8周齡 SCID.BG 、NOD.SCID IgG水平顯著低于4周齡和16周齡; 16周齡 NOD. SCID的 C4值顯著低于4周齡和8周齡。在補(bǔ)體含量上，兩個(gè)品系均顯示含量最高的是補(bǔ)體C3，含量最少的是補(bǔ)體C4。

表1 3個(gè)周齡SCID.BG、NOD.SCID主要免疫球蛋白和補(bǔ)體指標(biāo)

2.2 8周齡小鼠主要免疫細(xì)胞指標(biāo)測(cè)定

由表2免疫細(xì)胞測(cè)定的百分比數(shù)據(jù)可見, B220、NK1-1在整體免疫細(xì)胞占比大于T細(xì)胞群。SCID.BG小鼠在T細(xì)胞亞群中占比例最低為CD4+CD8+, 且顯著低于NOD.SCID小鼠。同品系在性別上無顯著差異。

表2 SCID.BG、NOD.SCID主要免疫細(xì)胞指標(biāo) %

3 討論

免疫球蛋白是血清或體液中一類具有抗體活性的蛋白質(zhì)，主要是丙種球蛋白，具有抗菌、抗病毒作用和加強(qiáng)細(xì)胞的吞噬作用，并在補(bǔ)體的協(xié)同作用下，殺死或溶解病原微生物，是機(jī)體抗感染免疫中的重要防御機(jī)制。補(bǔ)體是一組存在于人和動(dòng)物體液中及細(xì)胞表面，經(jīng)活化后具有生物活性，可介導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)的蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SCID.BG、NOD.SCID同品系同周齡在性別上各項(xiàng)指標(biāo)均無顯著差異。SCID.BG各周齡段在IgG水平上數(shù)值均顯著低于NOD.SCID, 在IgA水平上數(shù)值均顯著高于NOD.SCID。科研人員在做實(shí)驗(yàn)時(shí)需有針對(duì)性地選擇動(dòng)物品系。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SCID.BG、NOD.SCID兩個(gè)品系的免疫缺陷動(dòng)物，與免疫正常小鼠相比，其抗體含量均遠(yuǎn)低于正常小鼠的水平[7]。兩個(gè)品系與T、B雙缺陷免疫動(dòng)物CB-17SCID(簡(jiǎn)稱SCID)小鼠相比，SCID.BG與SCID免疫球蛋白和補(bǔ)體水平相近，但SCID小鼠品系同性別間有差異，而SCID. BG不存在性別間的差異[8]。NK細(xì)胞是非特異性免疫應(yīng)答中主要的效應(yīng)細(xì)胞，在抗病毒過程中發(fā)揮重要作用，有文獻(xiàn)報(bào)道[9]，SCID小鼠的NK細(xì)胞活性為普通小鼠的4倍，且SCID有嚴(yán)重的滲漏的現(xiàn)象，在免疫學(xué)研究時(shí)需剔除較多個(gè)體滲漏動(dòng)物。相對(duì)與SCID小鼠，SCID.BG、NOD.SCID兩個(gè)品系的免疫缺陷動(dòng)物更適用于免疫學(xué)的研究。

本實(shí)驗(yàn)采用脾臟組織進(jìn)行細(xì)胞分離, 測(cè)定T細(xì)胞及亞群、B細(xì)胞和NK細(xì)胞的百分比含量, 結(jié)果顯示B220、NK1-1在整體免疫細(xì)胞中占比大于T細(xì)胞群, 說明B細(xì)胞和NK細(xì)胞活性大于T細(xì)胞活性。此結(jié)果與外周血免疫細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比[8-10], 脾臟細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中CD3+、B220、NK1-1明顯高于外周血的百分比含量, 說明這些免疫細(xì)胞在脾細(xì)胞中的含量更高。

T細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，它的分化發(fā)育經(jīng)歷CD4-CD8-雙陰性T細(xì)胞的早期階段，CD4+CD8+雙陽性的中期階段, 分別進(jìn)行陽性和陰性選擇發(fā)育成只表達(dá)CD4+或CD8+的單陽細(xì)胞的后期階段。國(guó)外有關(guān)于CD4-CD8-雙陰性和CD4+CD8+雙陽性T淋巴細(xì)胞的報(bào)道[11,12]顯示, CD4+CD8+雙陽性T淋巴細(xì)胞具有比CD4+細(xì)胞更強(qiáng)的溶細(xì)胞效應(yīng),在下調(diào)MHC-I類分子的病毒感染中具有重要作用;另據(jù)資料表明[13,14], CD4+CD8+雙陽性T淋巴細(xì)胞還具有抗原特異性功能, 能夠產(chǎn)生疫苗誘導(dǎo)的記憶免疫誘答。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 8周齡SCID.BG小鼠CD4+CD8+雙陽性T淋巴細(xì)胞百分比顯著低于NOD.SCID, 顯示SCID.BG小鼠可能更適合用于此類研究。

通過以上兩個(gè)小鼠品系主要免疫指標(biāo)測(cè)定與比較結(jié)果證實(shí), SCID.BG與NOD.SCID兩者的抗體、補(bǔ)體, 免疫細(xì)胞指標(biāo)都處于微量水平, 同屬于T、B、NK重度免疫缺陷動(dòng)物, 可廣泛用于人體免疫功能重建和腫瘤學(xué)、血液學(xué)、免疫學(xué)等方面的研究。

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Detection of Main Immune Indexes in SCID. Beige and NOD.CB17-Prkdcscid Mice

YUAN Shui-juan1, SHI Guo-jun1, TANG Hui-qing1, XU Wen-jing1, FU Jie2, SHI Mei-lian2
(1. Shanghai Lingchang Bio-tech Company Limited, Shanghai 201402, China; 2. Shanghai SLAC Laboratory Animal Company Limited, Shanghai 201615, China)

ObjectiveTo measure the immunoglobulin, complement and main immune indexes in SCID. Beige and NOD.SCID mice and analyze their difference.MethodsThirty SCID.Beige and thiry NOD.SCID mice, half male and female, at the age of 4 weeks, 8 weeks and 16 weeks were selected for detecting the main immunoglobulin and complement indexes. Another fourteen SCID.Beige and fourteen NOD.SCID mice, half male and female, at the age of 8 weeks were also selected for detecting the T, B lymphocyte function and NK cell activity.ResultsThe IgG of SCID.Beige at all the age stages were significantly lower than those of NOD.SCID, but the IgA were significantly higher than those of NOD. SCID.The serum C4 of SCID.Beige mice at the age of 4 weeks and 16 weeks were significantly higher than those of NOD.SCID. The IgG of SCID.Beige and NOD.SCID mice at the age of 8 weeks were significantly lower than the other two age stages. In the T cell subsets, the CD4+CD8+percentages of SCID.Beige mice at the age of 8 weeks were significantly lower than those of NOD.SCID. Among the same sex and age group of NOD.SCID and SCID.BG, the immune indexes show no obvious differences .ConclusionsThe antibodies, complement and immune cell levels of SCID.Beige and NOD.SCID are significantly lower than normal mice. They all belong to severe immunodeficiency animals. Among the same age and sex group of the two strains, the immune indexes were different. So the animals should be selected according to the research purpose in the experiments.

SCID.Beige mice; NOD.CB17-Prkdcscid mice; Immunoglobulin; Complement; Immune cells

Q95-33

A

1674-5817(2016)05-0365-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.05.008

2016-06-17

上海市科委實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究專項(xiàng)(13140900500)

袁水娟(1981-), 女, 畜牧師, 從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)及管理。E-mail: ysjdyx123@163.com

施美蓮(1965-), 女, 高級(jí)畜牧師, 從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保種、育種、免疫缺陷動(dòng)物的研究以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究。E-mail: mlshi@slaccas.com