楊冠琦, 張 君

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院, 沈陽 110032)

芪薊腎康顆?？傸S酮對大鼠腎小球系膜細(xì)胞外基質(zhì)動態(tài)平衡的干預(yù)實驗

楊冠琦, 張 君

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院, 沈陽 110032)

目的 通過體外腎小球系膜細(xì)胞培養(yǎng)實驗，明確芪薊腎康顆?？傸S酮是否為組方的有效組分，探討其作用機制。方法 運用血管緊張素II誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞，使細(xì)胞外基質(zhì)增加, 經(jīng)芪薊腎康顆?？傸S酮干預(yù)后, 觀察白細(xì)胞介素-6(IL-6)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、纖維粘連蛋白(FN)和IV型膠原(Col IV)的蛋白表達(dá)。結(jié)果 與Ang II組比較芪薊腎康顆?？傸S酮可降低IL-6、MCP-1的蛋白表達(dá)，F(xiàn)N和IV型膠原的含量也都分別降低(P＜0.01)。結(jié)論 芪薊腎康顆粒總黃酮可能是通過調(diào)節(jié)促炎癥因子的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞外基質(zhì)過度積聚。

芪薊腎康顆?？傸S酮; 白細(xì)胞介素-6(IL-6); 單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1);

黃酮化合物(Flavonoids) 在植物界中廣泛存在，而且具有豐富多樣的生理活性，許多中藥中黃酮化合物的含量都極為豐富。近年來，不斷改進的提取、分離技術(shù)，使黃酮類化合物的研究熱點已經(jīng)由分離、提取高活性的黃酮類化合物，轉(zhuǎn)移到對其藥理作用的研究。過去的研究已經(jīng)證實了芪薊腎康顆粒中具有益氣、化瘀、解毒作用的中藥, 可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)降解酶，抑制由血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)的過度集聚[1,2]。為了明確芪薊腎康顆?？傸S酮是否為組方的有效組分并探討其作用機制，本實驗采用大孔樹脂吸附法提取顆粒中的總黃酮，運用血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞, 使細(xì)胞外基質(zhì)增加，經(jīng)芪薊腎康顆粒總黃酮干預(yù)后, 觀察白細(xì)胞介素-6(IL-6)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、纖維粘連蛋白(FN)和IV型膠原(ColIV)的蛋白表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細(xì)胞

SPF級SD大鼠15只，體質(zhì)量200～220 g，雌雄各半，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2011-0003]。HBZY-1大鼠原代腎小球系膜細(xì)胞株，武漢博士德生物技術(shù)有限公司，批號: CX0130。

1.2 實驗藥品與試劑

芪薊腎康顆?？傸S酮，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提供; 血管緊張素Ⅱ，日本W(wǎng)ako公司(批號: 014-18211); 胎牛血清, 美國Gibico公司(批號: 8131650); DMEM培養(yǎng)液, 美國Hyclone公司(批號: SH30022.01B); IL-6、MCP-1、FN、ColIV ELISA試劑盒為中國Bio-Swamp公司產(chǎn)品 (批號分別為: A20607, RA20492、RA20618、RA20284）

1.3 主要儀器及設(shè)備

雙人超凈臺，蘇州凈化設(shè)備廠; 離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠; 微孔板酶標(biāo)儀，美國伯樂公司;倒置式顯微鏡，日本Olympus公司; 二氧化碳培養(yǎng)箱，美國Thermo Forma公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 芪薊腎康總黃酮藥理血清的制備 15只SD大鼠, 隨機分為正常組、芪薊腎康總黃酮高、低劑量組3組, 每組5只。芪薊腎康顆粒臨床給藥劑量為每日155 g/kg, 總黃酮高劑量組生藥量每日30 g/kg (大鼠與人2倍等效劑量)。低劑量組生藥量每日15 g/kg(大鼠與人等效劑量)灌胃, 1次/日; 正常組給予生理鹽水。連續(xù)灌胃5 d, 第5日灌胃1 h后,腹主動脈取血, 1 500 r/min離心5 min，吸取上層血清。滅活處理條件: 56 ℃水浴, 30 min。0.22 μm的濾器過濾除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 腎小球系膜細(xì)胞的分組及培養(yǎng) 腎小球系膜細(xì)胞分為(1)正常組: 體積分?jǐn)?shù)10%正常大鼠血清+DMEM; (2)模型組：AngⅡ(10-7mol/L)+體積分?jǐn)?shù)10%正常大鼠血清+DMEM; (3)黃酮高劑量組: AngⅡ(10-7mol/L)+ 體積分?jǐn)?shù)10%高劑量黃酮血清+DMEM; (4)黃酮低劑量組：AngⅡ(10-7mol/L)+ 體積分?jǐn)?shù)10%低劑量黃酮血清+DMEM，每組設(shè)5個復(fù)孔。在25 cm2培養(yǎng)瓶中接種系膜細(xì)胞，加入培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM), 培養(yǎng)條件: 37℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2。待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶后, 換24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞, 接種密度: 2×104個/孔。體積分?jǐn)?shù)0.5%胎牛血清+DMEM培養(yǎng)24 h后，更換藥理血清(體積分?jǐn)?shù)10%)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞待測。

1.4.3 ELISA法檢測腎小球系膜細(xì)胞IL-6、MCP-1、FN、Col IV含量 應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法，嚴(yán)格按試劑盒所附說明書操作檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS11.0統(tǒng)計處理，進行單因素(One-Way)方差分析，表示, P＜0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-6、MCP-1含量變化

經(jīng)芪薊腎康顆?？傸S酮高、低劑量干預(yù)48 h后，模型組IL-6、MCP-1分泌量與正常組比較均增加(P＜0.01)。經(jīng)芪薊腎康顆?？傸S酮高、低劑量干預(yù)后，IL-6、MCP-1分泌量與模型組比較均有顯著降低(P＜0.01)(表1)。

表1 大鼠腎小球系膜細(xì)胞IL-6、MCP-1含量 μmol/L

2.2 細(xì)胞外基質(zhì)含量變化

經(jīng)芪薊腎康顆?？傸S酮高、低劑量干預(yù)48 h后，模型組FN、Col IV的分泌量與正常組比較顯著增加(P＜0.01)。芪薊腎康顆粒總黃酮高、低劑量組與模型組比較降低了FN、Col IV的含量(P＜0.01)(表2)。

表2 大鼠腎小球系膜細(xì)胞FN、Col IV含量 mmol/L

3 討論

腎小球疾病的重要病理特點之一是系膜細(xì)胞的增殖和系膜基質(zhì)明顯增多。而Ang II是RAS中最重要的效應(yīng)分子, 通過調(diào)節(jié)炎癥和纖維化兩個關(guān)鍵過程, 參與腎臟疾病的發(fā)病機制[5]。Ang II與Ang II 1型受體(AT1)作用后，可引起系膜細(xì)胞的增生、肥大，分泌多種細(xì)胞因子并合成細(xì)胞外基質(zhì)成分。AngII能使循環(huán)中的細(xì)胞粘附到系膜細(xì)胞，使炎癥細(xì)胞遷移到腎臟，從而導(dǎo)致炎癥細(xì)胞在腎臟的聚集，這個過程由粘附因子、細(xì)胞因子和趨化因子的上調(diào)所介導(dǎo)。Ang II通過AT1受體上調(diào)許多促炎癥基因的表達(dá)，如血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)和細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1) IL-6和MCP-1[6]。這些炎癥因子的表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)的積聚都是因為MAPK和NF-κB兩條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活[8-10]產(chǎn)生，最終導(dǎo)致腎臟損傷。

西醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎病患者感染后，可以通過不同機制促發(fā)炎癥反應(yīng)并產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)，例如IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等。作為攻擊性炎癥介質(zhì)，它們的啟動激發(fā)了炎癥反應(yīng)，使腎臟發(fā)生損傷。中醫(yī)學(xué)視感染為毒邪，當(dāng)毒邪入侵，肺、脾、腎三臟功能失調(diào)，導(dǎo)致血尿、蛋白尿和水腫臨床癥狀的發(fā)生。所以本方按照扶正祛邪的治療原則和病因病機，確立益氣，解毒和化瘀的治法，優(yōu)化院內(nèi)治療腎小球疾病的協(xié)定處方。本方總黃酮成分主要來源于黃芪、小薊和仙鶴草。黃芪具有益氣固本之功, 重樓、仙鶴草具有清熱解毒之效。臨床試驗證實黃芪顆粒能夠通過抑制IgA腎病患者血清中MCP-1、TNF-α和IL-6的表達(dá)，改善臨床癥狀[11]。亦有文獻報道, 重樓可以調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)，調(diào)控相關(guān)因子的分泌和炎癥遞質(zhì)的表達(dá)。例如, 其可通過抑制膜性腎病大鼠腎臟NF-κB的活化，減少細(xì)胞外基質(zhì)FN和ColIV的表達(dá), 參與延緩膜性腎病腎小球病理損害的過程[12]。從仙鶴草中提取的山柰酚和槲皮素能夠抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，從而控制各種炎癥因子的分泌，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生[13]。

本實驗結(jié)果表明: 芪薊腎康顆?？傸S酮高、低劑量組均降低了FN和Ⅳ型膠原的的蛋白表達(dá)，抑制了腎小球系膜細(xì)胞的積聚，說明細(xì)胞外基質(zhì)是芪薊腎康顆粒的作用靶點，同時也確定了總黃酮為處方的有效組分。IL-6、MCP-1的含量同樣隨之減少，降低了炎癥細(xì)胞在腎臟炎癥反應(yīng)中的趨化和激活作用，減少了炎癥細(xì)胞的浸潤，阻止了炎癥反應(yīng)的發(fā)生。前期研究表明芪薊腎康顆粒總黃酮可以干預(yù)MAPK和NF-κB兩條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)，故推測芪薊腎康顆粒總黃酮可能通過調(diào)控以上兩種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，來減少促炎癥因子表達(dá)并抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生，使細(xì)胞外基質(zhì)的分泌與降解恢復(fù)平衡，保護腎臟; 同時也說明了芪薊腎康顆粒組方原則的科學(xué)性和“益氣、解毒、化瘀”治法的有效性。

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Mechanism Analysis of Qiji Shenkang Total Granule Flavonoids on Regulating Glomerular Extracellular Matrix Dynamic Equilibrium through Inhibition of Inflammatory Response

YANG Guan-qi, ZHANG Jun
(Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032, China)

ObjectiveThrough in vitro mesangial cell culture experiments, to explore if the total flavonoids of Qiji Shenkang Granule is the key effective component in the Fufang, and to further explore its mechanism. Method Used the macroporous resin adsorption method to extract total flavonoids in Fufang, and then use vascular tension angiotensin II to induce apoptosis in cultured mesangial cell membrane, which increased the extracellular matrix, after the intervention of total flavonoids of Qiji Shenkang Granule, analyzed the effect of interleukin 6 (IL-6) and monocyte chemotaxis protein-1 (MCP-1), fibronectin (FN) and type IV collagen (ColIV) protein expression.Resultsthe Qiji Shenkang Granule flavonoids in high, dose group significantly reduced IL-6 and MCP-1 protein expression, FN and collagen content were also reduced, compared with Ang II group, P＜0.01.ConclusionBy regulating the expression of pro-inflammatory factors, the total flavonoids in the Qi Ji Shen Kang Granule can inhibit the excessive accumulation of extracellular matrix.

Qiji Shenkang Granule total flavonoids; Interleukin 6(IL-6); Monocyte chemotaxis protein-1 (MCP-1); Fibronectin (FN); Type IV collagen (ColIV)

R285.5 Q95-33

A

1674-5817(2016)05-0357-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.05.006

2016-07-06

科技部重大新藥創(chuàng)制專項( 2009ZX09103-394),公益性行業(yè)科研專項(201507001-03)

楊冠琦(1983-), 女,博士研究生。

E-mail:y_g_q1983@163.com

張 君(1956-), 女, 碩士, 從事中醫(yī)兒科腎臟病研究。 E-mail: zhangjun555678@sina.com

纖維粘連蛋白(FN); IV型膠原(Col IV)