高 峰, 張士更, 張 楠, 張布衣, 戴玉樑, 李紹江

(1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院, 杭州 310053; 2. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院泌尿外科, 杭州 310009)

慢性膀胱炎相關(guān)膀胱過(guò)度活動(dòng)癥大鼠模型的建立

高 峰1, 張士更2, 張 楠2, 張布衣2, 戴玉樑1, 李紹江1

(1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院, 杭州 310053; 2. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院泌尿外科, 杭州 310009)

目的 建立一種發(fā)病機(jī)制、尿流動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)與臨床相近的慢性膀胱炎相關(guān)膀胱過(guò)度活動(dòng)癥(OAB)大鼠模型。方法 將40只雌性SD大鼠隨機(jī)分為模型組和生理鹽水對(duì)照組; 模型組以大腸埃希氏菌膀胱灌注，3 d后搜集尿液常規(guī)顯微鏡檢查，證實(shí)膀胱炎并以慶大霉素灌胃每日4次，連續(xù)7 d，第10日復(fù)查尿常規(guī)，每隔10 d為1個(gè)周期，經(jīng)4個(gè)周期后行尿流動(dòng)力學(xué)檢查及膀胱HE染色病理學(xué)檢查。生理鹽水對(duì)照組用等量生理鹽水代替大腸埃希氏菌溶液，其余處理同模型組。2組同條件飼養(yǎng)。結(jié)果 模型組膀胱標(biāo)本可見(jiàn)少量上皮組織退變、凋亡、脫落，黏膜固有層見(jiàn)散在的淋巴細(xì)胞，行尿流動(dòng)力學(xué)檢查確認(rèn)13只建模成功。結(jié)論 通過(guò)大腸埃希氏菌ATCC35218反復(fù)膀胱灌注誘導(dǎo)SD大鼠慢性膀胱炎，最終可建立慢性膀胱炎相關(guān)OAB大鼠模型，為臨床上常見(jiàn)的膀胱炎后OAB的發(fā)病機(jī)制及治療、研究提供思路。

慢性膀胱炎; 膀胱過(guò)度活動(dòng)癥(OAB); 大腸埃希氏菌; 大鼠模型

膀胱過(guò)度活動(dòng)癥(overactive bladder, OAB)是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的慢性疾病, 表現(xiàn)為尿急, 伴或不伴急迫性尿失禁, 可嚴(yán)重影響生活質(zhì)量, 尿流動(dòng)力學(xué)上表現(xiàn)為逼尿肌過(guò)度活動(dòng)(detrusor overactivity, DO)[1]。目前在OAB的動(dòng)物研究中多以家兔、大鼠制造膀胱出口梗阻(bladder outlet obstruction, BOO), 少數(shù)采用腹腔內(nèi)注射環(huán)磷酰胺建立DO模型[2-4]。而臨床上發(fā)現(xiàn), 反復(fù)膀胱炎女性患者多并發(fā)OAB。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)反復(fù)大腸埃希氏菌ATCC35218膀胱內(nèi)灌注并予慶大霉素灌胃治愈, 探討反復(fù)膀胱炎后是否導(dǎo)致OAB？擬通過(guò)建立膀胱炎相關(guān)OAB動(dòng)物模型, 為進(jìn)一步探索臨床上常見(jiàn)的慢性膀胱炎后OAB發(fā)病機(jī)制及治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

SPF級(jí)雌性SD大鼠，40～45日齡，體質(zhì)量150～180 g, 購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[SCXK (浙)2016-0009]。將40只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成2組，模型組(A組, 20只)，生理鹽水對(duì)照組(B組，20只)，分籠飼養(yǎng)，自由飲水。

1.2 儀器、試劑與菌種

尿動(dòng)力檢查儀(荷蘭MMS公司, 型號(hào): MMS Solar), 分光光度計(jì)(日本Hitachi公司, 型號(hào): U-0080D), 正置顯微鏡(日本Olympus公司, 型號(hào): CX41)，大腸埃希菌(杭州百思生物技術(shù)有限公司,標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)號(hào): ATCC35218)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大腸埃希菌溶液的制備 從-70 ℃冰箱取出大腸埃希菌ATCC35218菌種，無(wú)菌條件下，挑起菌種用劃線法接種在血平板上，置于37 ℃恒溫，24 h后，挑取大腸埃希菌菌落至試管中，用生理鹽水溶解，分光光度儀測(cè)定大腸埃希菌，保持濃度在1×108～1.2×108CFU/mL(接種及培養(yǎng)由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科完成)。

1.3.2 膀胱灌注方法 無(wú)麻醉下抓取大鼠，反復(fù)擠壓大鼠下腹部直至未見(jiàn)尿液流出。用碘伏連續(xù)消毒尿道外口及周?chē)? cm皮膚3次，剪去醫(yī)用留置針針尖前部約0.5 cm，連接移液槍?zhuān)嘧?00 μL大腸埃希菌至膀胱內(nèi)，保持3 min后將大鼠放回籠中正常飼養(yǎng)。

1.3.3 各組處理方法 A組大鼠膀胱內(nèi)灌注大腸埃希菌ATCC35218(1×108～1.2×108CFU/mL) 100 μL, 3 d后搜集尿液常規(guī)顯微鏡檢查，后予慶大霉素(0.5 mL，2萬(wàn)單位)灌胃每日4次，連續(xù)7 d進(jìn)行治療，第10日復(fù)查尿常規(guī)，如此10 d為1個(gè)周期，共4個(gè)周期后行尿流動(dòng)力學(xué)檢查，并取膀胱標(biāo)本行HE染色。B組用同等量生理鹽水代替大腸埃希氏菌溶液，其余處理方法同模型組。2組同條件飼養(yǎng)。

1.3.4 DO檢測(cè)及判定方法 將質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%戊巴比妥以35 mg/kg腹腔注射，10 min后同膀胱灌注法常規(guī)消毒，尿道外口插入外徑1 mm 軟質(zhì)硬膜外麻醉管入膀胱，經(jīng)三通裝置連接微量灌注泵與尿動(dòng)力學(xué)檢查儀，輕壓腹部至排凈尿液。膀胱灌注液采用37 ℃生理鹽水，速度為0.05 mL/min，從灌注開(kāi)始到排尿時(shí)停止。每只大鼠檢測(cè)4次。若膀胱充盈期逼尿肌不穩(wěn)定收縮波存在且2次及以上，則判定為陽(yáng)性，即DO或OAB。若不穩(wěn)定收縮波只出現(xiàn)1次，則第2日再次行尿動(dòng)力檢測(cè)，仍在1次及以下判定為陰性。

1.3.5 尿常規(guī)及病理檢測(cè) 在各組大鼠尿流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)束后, 頸椎脫臼法處死, 迅速剪開(kāi)下腹部皮膚,暴露膀胱, 用0.5 mL針筒抽取全部尿液, 離心沉淀后高倍鏡鏡檢，以+(陽(yáng)性，白細(xì)胞數(shù)＞5個(gè)/每高倍鏡視野)或－(陰性, 白細(xì)胞數(shù)0～5個(gè)/每高倍鏡視野)表示。取2組大鼠的膀胱組織固定后, 行常規(guī)組織切片, HE染色, 若A組大鼠出現(xiàn)DO的同時(shí)切片鏡檢膀胱上皮組織未見(jiàn)細(xì)菌菌落，上皮組織基本完好且未見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn), 表明造模成功。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將數(shù)據(jù)整理后錄入EXCEL中，分析時(shí)讀入SPSS19.0中進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組間采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

A組大鼠在大腸埃希菌灌注期間死亡2只, 慶大霉素灌胃期間死亡1只; B組在灌胃期間死亡2只，死亡大鼠均在處理后第2日發(fā)現(xiàn)。灌胃時(shí)個(gè)別大鼠在進(jìn)針、推藥時(shí)掙扎明顯，放回籠中后略顯虛弱及疲態(tài)，對(duì)刺激反應(yīng)較差，可見(jiàn)類(lèi)嘔吐表現(xiàn)，第2日大鼠口腔中發(fā)現(xiàn)陳舊性血跡，考慮可能因操作不當(dāng)至消化道穿孔或誤注入氣管引起。A、B組膀胱灌注后觀察，A組個(gè)別大鼠趴在籠中類(lèi)似寒戰(zhàn)表現(xiàn)，偶見(jiàn)小范圍跑動(dòng)的異常興奮表現(xiàn)，可能此時(shí)已出現(xiàn)感染性休克初期表現(xiàn)。

2.2 尿流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)

在測(cè)量前將膀胱內(nèi)壓、腹壓以及逼尿肌壓力均設(shè)為0 cmH2O。A組膀胱充盈期不穩(wěn)定收縮波明顯增多，排尿時(shí)間明顯(圖1A); B組以出現(xiàn)一逼尿肌正常排尿的收縮波為主(P＜0.05)。此外，觀察到首次收縮波出現(xiàn)時(shí)間也較B組提前(圖1B)。

圖1 大鼠尿流動(dòng)力學(xué)排尿期收縮波

表1 各組大鼠膀胱充盈期不穩(wěn)定收縮及4次尿白細(xì)胞陽(yáng)性率比較

2.3 尿常規(guī)檢查

4次尿常規(guī)白細(xì)胞檢測(cè): A組大腸桿菌膀胱灌注3 d后白細(xì)胞陽(yáng)性率均為100%，治療后陽(yáng)性率在11.8%以下; B組膀胱灌注及治療后陽(yáng)性率在5.6%以下。A、B組膀胱尿流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性占比分別為76.5%、5.6%(表1)。這一現(xiàn)象符合臨床治愈診斷且A、B組大鼠膀胱炎患病率出現(xiàn)差異(P＜0.05)。

圖2 各組大鼠膀胱上皮病理學(xué)觀察(HE×400)

2.4 膀胱組織學(xué)檢查

A組死亡大鼠膀胱組織切片鏡檢可見(jiàn)上皮組織大量脫落，大量桿菌分布于黏膜，血管周?chē)芯涑蓤F(tuán)出現(xiàn)(圖2A); A組大鼠治療4個(gè)周期后膀胱上皮可見(jiàn)少量黏膜上皮退變、壞死、凋亡、脫落，較B組變薄，黏膜固有層輕微水腫, 出現(xiàn)散在淋巴細(xì)胞(圖2B), 共13只大鼠造模成功, 成功率76.5%。B組大鼠鏡下可見(jiàn)黏膜上皮完好，偶見(jiàn)凋亡脫落，未見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞及水腫形成(圖2C)。

3 討論

OAB目前已成為泌尿外科常見(jiàn)病, 在我國(guó)總體發(fā)病率約為6%, 40周歲以上人群發(fā)病率高達(dá)11.3%,其中男性約占5%，女性約占6%，隨年齡增長(zhǎng)發(fā)病率增高[5]。預(yù)計(jì)到2018年，全球范圍約有5.46億OAB患者。在部分西方國(guó)家OAB已成為十大常見(jiàn)慢性病之一，嚴(yán)重影響患者身心健康和工作，日益成為家庭及社會(huì)的沉重負(fù)擔(dān)[6]。其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前主要認(rèn)為有兩種機(jī)制，神經(jīng)源性學(xué)說(shuō)與肌源性學(xué)說(shuō)，其中肌源性學(xué)說(shuō)因Cajal 間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)被廣泛認(rèn)可[7,8]。

膀胱炎多見(jiàn)于女性患者，以上行性感染多見(jiàn)。分為急性膀胱炎和慢性膀胱炎，臨床上多見(jiàn)于慢性膀胱炎，約85%均由大腸埃希菌引起，其次為葡萄球菌，變形桿菌等。慢性膀胱炎由于膀胱感覺(jué)過(guò)敏，可出現(xiàn)尿頻尿急等逼尿肌過(guò)度活動(dòng)(DO)癥狀[5,9]。但經(jīng)抗生素治療尿常規(guī)白細(xì)胞陰性后，部分患者仍有DO癥狀; 其發(fā)病機(jī)制是由于膀胱炎并未真正治愈，還是反復(fù)膀胱炎癥繼發(fā)OAB等引起?目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)大鼠膀胱內(nèi)反復(fù)灌注大腸埃希菌建立慢性膀胱炎并以尿常規(guī)檢測(cè)確認(rèn)。在慶大霉素治療至尿白細(xì)胞陰性后再行尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)。同時(shí)予膀胱HE染色鏡檢明確膀胱炎治愈情況，從而排除因膀胱炎直接引起DO癥狀的可能性。因雄性大鼠尿液可由輸精管返流入精囊，改變膀胱內(nèi)壓，在尿流動(dòng)力學(xué)檢查過(guò)程中影響膀胱功能的評(píng)估，因此本實(shí)驗(yàn)全部采用雌性大鼠。

實(shí)驗(yàn)中， A組大鼠在灌注大腸埃希菌期間死亡2只，將死亡大鼠取出膀胱行HE染色，見(jiàn)大量上皮脫落，血管擴(kuò)張充血，血管內(nèi)見(jiàn)大量菌落成團(tuán)。考慮可能由于尿路感染最終引起敗血癥、感染性休克而死亡。灌胃期間3只大鼠死亡，考慮主要為操作不當(dāng)引起：灌胃致消化道穿孔或注射入呼吸道。A組在尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)中，膀胱充盈期不穩(wěn)定收縮波較B組陽(yáng)性率明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明造模成功，且逼尿肌收縮的時(shí)間早于B組，這一現(xiàn)象可能因膀胱感覺(jué)過(guò)敏引起。而A組仍有23.5%的大鼠尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)為陰性，分析原因:①所有大鼠均在麻醉過(guò)程中檢測(cè)，由于麻醉可抑制逼尿肌的自發(fā)收縮活動(dòng)和排尿反射，因此會(huì)出現(xiàn)一定概率的假陰性; ②膀胱炎病程較短，部分大鼠未能夠造成病理生理改變，從而未引起DO。

目前在國(guó)內(nèi)外OAB的動(dòng)物研究中, 多數(shù)采用家兔、大鼠, 通過(guò)對(duì)尿道進(jìn)行結(jié)扎、放置金屬環(huán)等不同手段, 增加尿道排尿阻力, 從而模擬老年男性前列腺增生引起的DO模型[2,3]。而臨床上女性患者OAB的產(chǎn)生多因反復(fù)慢性膀胱炎引起，并非長(zhǎng)期的后尿道梗阻。本實(shí)驗(yàn)首次通過(guò)慢性膀胱炎為誘因建立DO模型。慢性膀胱炎造模參考既往文獻(xiàn)[10,11], 采用大腸埃希菌膀胱內(nèi)灌注, 濃度為1.2×108CFU/mL，通過(guò)該方法，可以成功建立慢性膀胱炎大鼠模型。然后，在該模型的基礎(chǔ)上進(jìn)一步建立DO模型。

臨床上OAB的治療并不理想，通過(guò)行為治療，口服藥物治療等方法雖有一定療效，但仍不能完全治愈，且長(zhǎng)期用藥易出現(xiàn)耐受[5]。因此，OAB的基礎(chǔ)研究仍期待新的突破。過(guò)去的研究表明: 在BOO引起OAB的動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn): 膀胱肌層內(nèi)存在Cajal細(xì)胞(ICC細(xì)胞)，該細(xì)胞具有自發(fā)性電位，逼尿肌過(guò)度活動(dòng)的逼尿肌中ICC細(xì)胞數(shù)量明顯增加，細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)化更加明顯[12]。本文提供了一種新的大鼠OAB模型建立方法，為進(jìn)一步研究慢性膀胱炎與OAB以及膀胱炎后OAB與Cajal 間質(zhì)細(xì)胞的相關(guān)性提供了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為膀胱炎相關(guān)OAB臨床疾病預(yù)防和治療提供新的思路。

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Establishment of Over Active Bladder Model Associated with Chronic Cystitis in Rat

GAO Feng, ZHANG Shi-geng, ZHANG Nan, ZHANG Bu-yi, DAI Yu-liang, LI Shao-jiang
(1. The 2nd Clinical Medical College, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China; 2. Department of Urology, The Second Affiliated Hospital Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310009, China)

ObjectiveTo build the over active bladder (OAB) related to chronic cystitis model which is similar to clinical process including pathogenesis and urodynamic performance.MethodsForty female SD rats were randomly divided into model group and saline control group. Model group: the bladders were instilled with Escherichia coli ATCC35218 (1×108～1.2×108CFU/mL) 100 μL, and a urine test were done after 3 days to confirm cystitis. The rats were given by gavage with Gentamicin (0. 5 mL, 2 million units) 4 times a day × 7 days and urine were retested 10 days a cycle. The rats were done urodynamics and HE staining for bladder tissue after 4 cycles. Saline control group: were given by gavage with the same amount of saline solution instead of Escherichia coli, the remaining process was the same as the model group. The animals were raised under the same conditions.ResultsA small amount of epithelial was found degeneration, apoptosis, loss, and scattered lymphocytes in the lamina propria in model group. Thirteen rats were successfully modeled.ConclusionThe OAB animal model can be established after cystitis by repeated E.coli infusion into bladder of female SD rats’. It offers ideas for pathogenesis, treatment and research about OAB associated with chronic cystitis.

Chronic cystitis; Overactive bladder (OAB); Escherichia coli; Rat model

Q95-33

A

1674-5817(2016)05-0340-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.05.003

2016-05-26

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012ZA058)

高 峰(1990-), 男, 碩士研究生。

E-mail: 934563340@qq.com

張士更(1973-), 男, 主任醫(yī)師。

E-mail: 22676251@qq.com