楊 倩, 郁 琳, 顧 艷, 石 燕, 何亞萍, 王 健

(1. 上海市計劃生育科學研究所, 上海 200032; 2. 天津醫(yī)科大學附屬二院, 天津 300211)

·論 著·

米非司酮導致孕激素功能不足的自然流產小鼠模型的建立及其評價

楊 倩1, 郁 琳1, 顧 艷2, 石 燕1, 何亞萍1, 王 健1

(1. 上海市計劃生育科學研究所, 上海 200032; 2. 天津醫(yī)科大學附屬二院, 天津 300211)

目的 建立孕激素功能不足導致的自然流產小鼠模型，為自然流產發(fā)生機制以及孕期補充孕激素臨床規(guī)范的研究提供理想的動物模型。方法 成年雌性小鼠隨機分成米非司酮(RU486)高劑量組(50 μg/100 μL丙二醇)、中劑量組(25 μg/100 μL丙二醇)、低劑量組(10 μg/10 μL丙二醇)和溶劑對照組(100 μL丙二醇/只)，于妊娠8 d經頸背部皮下注射RU486或溶劑后，分別于妊娠10 d和分娩后觀察妊娠狀況和窩產仔數(shù); 于妊娠10 d取各組小鼠外周血和子宮組織，對各組小鼠的血清雌二醇(E2)和孕酮(P4)水平進行檢測; 應用基因芯片技術，對實驗組與對照組間的子宮組織差異表達基因進行篩查分析，并通過Western blot檢測，對其中3個差異表達基因進行了驗證。結果 高、中和低劑量組流產率分別為100%、46.0%和13.9%，且中劑量組妊娠鼠子宮內均為停育被吸收的胚胎，而低劑量組的仔鼠出生體質量顯著小于對照組(P＜0.05); 與對照組相比，中劑量組妊娠鼠血清E2水平升高(P＜0.05)、P4水平降低(P＜0.001)，而低劑量組妊娠鼠血清中E2水平降低(P＜0.05)、P4水平升高(P＜0.05)。經基因芯片檢測和Western blot驗證表明，與對照組相比，細胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)基因在中劑量組子宮組織中的表達量顯著降低(P＜0.05)，促細胞凋亡因子(Bax)基因的表達量也顯著性降低(P＜0.05)，而細胞周期蛋白D2(CCND2)基因的表達量則顯著升高(P＜0.05)。結論 適當劑量的RU486可誘導胚胎著床后妊娠鼠出現(xiàn)妊娠丟失或新生仔鼠體質量降低的表型, 可能成為一種新的可用于研究人妊娠期孕酮功能不足所致的流產或宮內生長受限等病理妊娠發(fā)生機制的動物模型。

米非司酮(RU486); 自然流產(IUGR); 宮內生長受限; 細胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4);促細胞凋亡因子(Bax)

人類正常妊娠過程的建立和維持需要經歷胚胎植入、胎盤形成、胚胎發(fā)育等一系列重要環(huán)節(jié)，受到多個層面不同系統(tǒng)的協(xié)同調控，其中任一環(huán)節(jié)障礙均會導致自然流產等不良妊娠結局。根據(jù)“歐洲人類生殖和胚胎學學會”(European Society of Human Reproduction and Embryology，ESHRE)的定義, 自然流產可分為“生化流失”和“臨床流產”[1]。據(jù)估計[2], 人類妊娠中生化流失率達60%;早期(妊娠12周之前)臨床流產率達15%，而晚期(妊娠12周～22周)臨床流產率約為4%[3]。自然流產是不育癥的主要表現(xiàn)之一，其病因復雜，涉及到遺傳、內分泌、解剖、感染和免疫等眾多因素[4]，只有對其病理機制有深入的了解，才能發(fā)展更有效、更安全的臨床干預技術。但限于倫理問題，無法直接在人體開展相關研究，因此，建立符合人類自然流產特征的動物模型具有重要意義。目前已有多種自然流產動物模型，其中應用最為廣泛的是DBA/2♂×CBA/J♀小鼠模型，其流產率在15%～30%[5], 但該模型主要是模擬遺傳因素所致的自然流產, 并不能模擬內分泌異常導致的自然流產。

雌激素、孕激素在妊娠建立和維持過程中發(fā)揮重要作用，而隨著女性年齡增長，其卵巢功能會不斷下降，因此，高齡育齡婦女妊娠后容易出現(xiàn)雌、孕激素功能不足而導致妊娠丟失的問題。建立孕激素功能不足所致自然流產的小鼠模型，對于其病理機制和干預方案的研究具有重要意義。米非司酮(mifepristone，RU486)是一種孕激素受體拮抗劑，目前臨床主要用于終止妊娠(16周前)[6]。RU486主要是通過干擾子宮內膜容受性和母胎界面免疫耐受狀態(tài)的形成和維持，以及誘導滋養(yǎng)層細胞的凋亡而終止妊娠[7,8]。為此, 作者設想, 在一定劑量下，RU486可能通過干擾孕激素信號通路而模擬孕激素功能不足的臨床表型，可用于建立孕激素功能不足的自然流產小鼠模型，從而為自然流產病理機制的臨床診療技術的研究提供有用的實驗工具。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級8周齡ICR雌、雄性小鼠購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[SCXK(滬)2008-0016]，飼養(yǎng)于上海市計劃生育科學研究所SPF級嚙齒類實驗動物設施[SYXK(滬)2013-0027], 溫度22～25 ℃，光照14 h∶10 h，自由飲水、攝食。所有實驗動物的操作均遵循國家實驗動物管理條例和上海市計劃生育科學研究所實驗動物管理條例。

1.2 主要試劑

RU486片(25 mg/片)購自北京紫竹藥業(yè)有限公司(生產批號3110503); 1,3-丙二醇購自生工生物工程有限公司(生產批號SJ0312S2012); 兔抗小鼠促細胞凋亡因子(Bax) 抗體購自美國Cell Signaling Technology公司; 兔抗小鼠細胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)抗體和兔抗小鼠細胞周期蛋白2(CCND2)抗體均購自博士德公司; 兔抗β-actin多克隆抗體購自(美國) Proteintech公司; HRP標記的羊抗兔IgG二抗購自美國)Zymed公司。

1.3 實驗動物的給藥處理

每日肉眼觀察結合陰道涂片判斷發(fā)情期, 于雌鼠發(fā)情期時當日17∶00, 將雌、雄小鼠按2∶1比例合籠; 次日8∶00檢查雌性小鼠陰道栓, 發(fā)現(xiàn)陰道栓者計為妊娠 1 d。將RU486片碾碎研細后, 用1,3-丙二醇溶解配制成高(500 μg/mL)、中(250 μg/mL)、低(100 μg/mL)三種濃度的RU486溶液。將妊娠小鼠隨機分成4組: (1)高劑量組: 每只妊娠鼠注射100 μL高濃度RU486溶液; (2)中劑量組: 每只妊娠鼠注射100 μL 中濃度RU486溶液; (3)低劑量組: 每只妊娠鼠注射100 μL 低濃度RU486溶液; 和(4)對照組:每只妊娠鼠注射100 μL丙二醇。于妊娠8 d上午9∶00, 于頸背部皮下注射。

1.4 實驗動物的表型觀察和取材

于妊娠10 d頸椎脫臼法處死經給藥處理的妊娠鼠，取子宮，觀察胚胎的數(shù)量和發(fā)育情況，并收集胚胎植入部位和非植入部位的子宮組織; 或等待妊娠鼠自然分娩，觀察窩仔鼠數(shù)及仔鼠體質量。部分小鼠于妊娠10 d，按每只小鼠0.1 mL/100 g的劑量給予體積分數(shù)3%戊巴比妥鈉溶液麻醉后，經心臟取血，用于檢測血清的中雌、孕激素水平。

1.5 血清雌、孕激素水平的檢測

收集妊娠10 d中劑量組、低劑量組以及對照組小鼠全血，分離血清，送上海計生所醫(yī)院檢驗科使用電化學發(fā)光法分別檢測血清中雌二醇(E2)和孕酮(P4)的分泌水平。

1.6 cDNA芯片檢測

取妊娠10 d各組妊娠鼠(n=3)子宮胚胎植入部位子宮組織，去除胚胎后，委托晶能生物(上海)技術有限責任公司，使用1張IlluminaBeadChip芯片(芯片類型:MouseWG-6_V2，晶能生物上海有限公司)，對3個實驗組和1個對照組的子宮組織中差異表達基因進行了篩選。將P＜0.05，F(xiàn)old Change(倍性變化)＞2.0的基因設定為差異表達基因，并通過GenomeStudio軟件分析了差異表達基因的相關性。

1.7 Western blot檢測

將蛋白40 μg/孔上樣至12% SDS-PAGE凝膠中電泳，停止電泳后將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，取膜后加6% TBST脫脂奶粉封閉液，將膜按要求(所加抗體不同)剪開，分裝于不同的皿盒中，加入待測抗體(抗體濃度參照說明書), 4℃過夜，次日洗膜后加入待測抗體相應的二抗(按說明書稀釋),室溫孵育2 h，洗膜后顯色，在Tanon5200全自動化學發(fā)光成像分析儀上，應用Image J生物圖像分析系統(tǒng)對檢測結果進行分析。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 RU486對小鼠胚胎植入后妊娠過程的影響

于妊娠10 d觀察到，對照組妊娠鼠(n=7)子宮內胚胎呈串珠狀分布、羊膜囊完整(圖1A)，剝離后的胚胎呈光潔粉紅色且大小均勻(圖1D); 低劑量組妊娠鼠(n=5)子宮內胚胎呈串珠狀分布、羊膜囊完整，剝離后的胚胎外觀與對照組沒有明顯區(qū)別，胚胎數(shù)量與重量與對照組相比, 均顯著降低, 流產率約為13.9%(表1); 中劑量組妊娠鼠(n=5)子宮內未見羊膜囊及正常胚胎(圖1B)，有胚胎呈污黃色腐敗狀態(tài)(圖1E)，胎盤呈凝血塊狀且已脫離子宮壁, 在宮腔內呈游離狀態(tài), 胚胎數(shù)量與重量與對照組相比, 也均顯著降低，流產率約為46.0%(表1); 高劑量組妊娠鼠(n=15)子宮內均未見胚胎或妊娠產物(圖1C)，提示完全流產(表1)。對低劑量組小鼠的分娩情況進行觀察表明，低劑量組妊娠鼠(n=3)的窩產仔數(shù)和仔鼠尾長與對照組沒有顯著差異，但仔鼠的出生體質量、頂臀徑顯著低于對照組(P＜0.01)(表2)。

圖1 妊娠10 d各組小鼠的代表性子宮組織和胚胎Figure 1 Morphological observation on uterine and embryonic tissue in pregnant mice at 10 days

表1 RU486對妊娠10 d小鼠的影響Table 1 Effect of RU486 on pregnant mice at 10 days

2.2 RU486對妊娠鼠血清E2、P4水平的影響

與對照組相比，低劑量組小鼠血清E2水平顯著降低，而P4水平顯著升高(P＜0.05); 相反，中劑量組小鼠血清E2水平顯著升高(P＜0.05)，而P4水平顯著降低(P＜0.01)(表3)。

2.3 RU486對妊娠鼠子宮組織基因表達譜的影響

在給藥組和對照組間共有2 422個差異表達基因(差異倍數(shù)超過2倍，且P＜0.05)。進一步在差異表達基因所涉及的信號通路中，選擇了與胚胎著床及子宮容受性密切相關的粘附分子、趨化因子、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和P53相關信號通路進行相關性分析(圖2)。為了驗證基因芯片檢測結果，應用Western blot方法，對Bax、CDK4以及CCND2三個基因在妊娠10 d中劑量組小鼠(n=3)和對照組小鼠(n=3)子宮組織中的表達水平進行了檢測分析，結果顯示: 與對照組相比，CDK4基因在RU486給藥組小鼠子宮組織中的表達水平顯著降低(P＜0.05)(圖3)，CCND2基因在RU486給藥組小鼠子宮組織中的表達量顯著升高(P＜0.05)(圖4)，而Bax基因在RU486給藥組小鼠子宮組織中的表達量則顯著性降低(P＜0.05)(圖5)。

表2 低劑量RU486對妊娠鼠結局的影響Table 2 Effects of low doses of RU486 on pregnant outcome in mice

表3 RU486對妊娠10 d小鼠血清中E2、P4水平的影響Table 3 Effect of RU486 on serum E2、and P4 levels in pregnant mice at 10 days

3 討論

圖2 差異基因相關性的Genome Studio分析結果Figure 2 Analysis result of Genome Studio of the difference genes correlation

圖3 RU486誘導流產小鼠子宮組織中CDK4的表達水平的Western blot檢測Figure 3 Western blot analyses of uterine CDK4 in RU486-induced abortion mice

圖4 RU486誘導流產小鼠子宮組織中CCND2的表達水平的Western blot檢測Figure 4 Western blot analyses of uterine CCND2 in RU486-induced abortion mice

圖5 RU486誘導流產小鼠子宮組織中Bax的表達水平的Western blot檢測Figure 5 Western blot analyses of uterine Bax in RU486-induced abortion mice

本研究中，于妊娠第8天對小鼠通過頸背部皮下注射給藥后，高劑量RU486(50 μg/只)可導致妊娠鼠完全流產，子宮內未見有胚胎; 中劑量RU486 25 μg/只)可誘導產生46.0%的流產率, 且子宮內均為停育的胚胎，顯示出明顯的自然流產表型; 而低劑量RU486(10 μg /只)不能有效誘導妊娠鼠流產，但可導致仔鼠出生體重降低, 顯示出宮內生長受限(intra-uterine growth restriction, IUGR)的表型。

與對照組相比，中劑量組妊娠鼠血清E2水平顯著升高，而P4水平顯著降低，提示其重新進入動情周期，與人類自然流產后卵巢排卵功能恢復而導致血清中雌、孕激素水平的變化趨勢相一致; 同時，低劑量組小鼠血清中P4水平顯著升高，提示孕激素功能不足，而此時E2水平有所降低，以保證妊娠正常進行，但會導致不良的妊娠結局，并與人類子癇前期導致的宮內生長受限(IUGR)母體血清中雌、孕激素的變化趨勢相一致[9-11]。

IUGR，又稱宮內發(fā)育遲緩，是指胎兒宮內生長未達其遺傳的生長潛能，臨床上通常指小于胎齡兒，即新生兒出生體重低于同胎齡同性別平均出生體質量的第十百分位數(shù)或兩個標準差[12]。IUGR是造成圍產期胎兒/嬰兒死亡的主要原因之一，還與成年期健康密切相關，受到研究者廣泛關注。但目前沒有理想的動物模型輔助研究，導致對IUGR發(fā)病機制的認識仍然較為片面。本研究中，低劑量的RU486可引起新生仔鼠體重降低，可能成為一種新的IUGR小鼠模型。

導致女性自然流產的因素有很多，主要包括:①男性精子，女性卵子的老化都會導致胚胎發(fā)育不良繼而發(fā)生流產現(xiàn)象; ②備孕一方或雙方存在染色體異常, 會直接影響胚胎健康引發(fā)女性流產; ③母體免疫異常，導致胎兒被母體排斥; ④環(huán)境致畸因素導致胎兒染色體畸變; ⑤母體微生物感染; ⑥男性精子問題造成的胚胎發(fā)育不良; ⑦母體孕育器官的畸形;⑧女性內分泌失調也可導致自然流產[13]。妊娠過程中，高濃度的孕激素對于胚胎和胎兒的生長和發(fā)育是必須的，母體在很大范圍內對于高劑量的孕激素耐受，但是雌激素水平過高能夠顯著抑制胎兒和胎盤的生長發(fā)育, 使流產風險大大增加[12,14]。RU486是一種類固醇類的抗孕激素制劑, 與孕激素受體有較強的親和力, 能有效阻斷天然P4活性[15,16], 因此可用于終止妊娠。本研究中, 高劑量組子宮內未見有胚胎，提示高劑量的RU486可能通過干擾孕激素對蛻膜Th1/Th2/Th17/Treg細胞功能的調控作用, 促進絨毛及蛻膜組織壞死, 從而打破母-胎界面免疫耐受狀態(tài), 最終導致妊娠過程終止[7,17]。此外, 外周血清中P4水平的顯著下降，而雌激素水平異常升高也是導致妊娠失敗的可能原因之一[14]。中劑量組子宮內有數(shù)量明顯減少且已停育的胚胎，而低劑量組子宮內的胚胎數(shù)量和外觀均無顯著變化，但胚胎重量顯著降低，顯示出明顯的劑量-效應關系，提示低劑量的米非司酮只能部分抑制孕激素的功能而導致胎兒生長受限。

在正常胚胎植入及妊娠維持過程中，蛻膜及絨毛組織中各類細胞的增殖和凋亡處于動態(tài)平衡，以保持母-胎界面微環(huán)境的穩(wěn)定，維持胚胎的正常生長發(fā)育。已有研究證實[18,19]，RU486促使孕早期兔和大鼠子宮內膜細胞凋亡活性增加的作用會打破這種動態(tài)平衡, 誘發(fā)流產。另有報道, RU486能促進早孕細胞絨毛合體滋養(yǎng)層細胞，蛻膜間質及腺上皮細胞的凋亡, 且主要是通過Fas/FasL途徑介導,并且與Bax也有一定相關性[20]。但是細胞是否走向凋亡結局由Bax/Bcl-2的比值決定，同時Bax/Bcl-2比值對人和大鼠月經周期和動情周期子宮內膜的生長和衰退作用重大[20,21]。近期研究結果顯示, 反復自然流產患者蛻膜組織中Bax的表達水平異常降低23]。令人感興趣的是, 本研究也證實RU486處理后,小鼠子宮組織中Bax的表達水平也顯著降低, 提示Bax可能是反復自然流產的一種生物標志分子。

此外, 有研究報道[24,25], RU486可以影響細胞周期進程, 使子宮局部組織內細胞增殖與凋亡失衡，最終導致流產; CDK4是與G1期正向調節(jié)密切相關的因子, 也可與CCND2相互作用發(fā)揮生理功能。在本研究中，RU486處理后妊娠鼠子宮組織中CDK4的表達水平顯著降低，而CCND2基因的表達水平則顯著上升，均可抑制細胞正常增殖，打破細胞增殖和凋亡平衡，可能是導致流產的一種病理機制，但有待進一步研究證實。

綜上所述, 用不同劑量的RU486處理妊娠8 d的ICR小鼠, 可導致自然流產或胎兒宮內生長受限，其血清雌、孕激素水平的變化模式也分別與人類自然流產或由于子癇前期導致的IUGR患者相一致，提示可用于建立自然流產小鼠模型或IUGR小鼠模型，從而為臨床研究RU486單獨用藥導致妊娠終止的作用機制提供一種新的動物模型。

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Establishment and Evaluation of Spontaneous Abortion Mouse Models of Progesterone Insufficiency Induced by Mifepristone

YANG Qian1, YU Lin1, GU Yan2, SHI Yan1, HE Ya-ping1, WANG Jian1
(1. Shanghai Institute of Planned Parenthood Research, Shanghai 200032, China; 2. The Second Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300211, China)

ObjectiveTo establish spontaneous abortion mouse models of progesterone insufficiency induced by mifepristone (RU486) to provide an ideal animal model for the mechanism of spontaneous abortion and clinical practice of supplying progesterone in pregnancy period.MethodsAdult female mice were randomly divided into a RU486 high-dose group (50 μg/100 μL propylene glycol/only), middledose group (25 μg/100 μL propylene glycol/only), low-dose group (10 μg/100 μL propylene glycol/only) and solvent control group (100 μL propylene glycol/only). A subcutaneous injection of RU486 or solvent was given on pregnancy day 8, and the phenotype of pregnant mice and neonatal mice were observed on pregnancy day 10(d10) and after their delivery. The peripheral blood and uterus tissues of the mice in each group were collected on d10 to detect the levels of their serum estradiol (E2) and progesterone(P4). The uterine tissue differentially expressed genes between the experimental and control groups were screened and analyzed by Gene Chip Technology, and three of them were validated by Western blot.ResultsThe abortion proportions were 100%, 46.0% and 13.9% respectively in the high-dose group, middle-dose group and lowdose group, and some embryos stopped developing and were absorbed in the uterus were observed in the middle-dose group, whereas the newborn mouse birth weights in the low-dose group were significantly lower than those in the control group (P＜0.05). Compared with those of the control group, the E2levels of the pregnant mice serum of the middle-dose group were increased (P＜0.05) and P4levels were decreased (P＜0.001), while the E2levels of the pregnant mice serum of the low-dose group were decreased (P＜0.05), and P4levels were increased (P＜0.05). The Gene Chip and Western blot analysis and verification discovered that the expression of CDK4 in the uterine tissues was significantly reduced in the middle-dose group (P＜0.05) compared with the control group, the expression of Bax was also significantly decreased (P＜0.05), whereas the expression of CCND2 significantly increased and was statistically significant (P＜0.05).ConclusionThe appropriate dose of RU486 able to induce the pregnancy loss of pregnant mice after embryo implantation or neonatal weight loss. It might become a new animal model to be used for study of pathological mechanisms of the abortion or intrauterine growth restriction induced by progesterone deficiency in women pregnancy period.

Mifepristone(RU486); Spontaneous abortion; IUGR; CDK4; Bax

R714.21 Q95-33

A

1674-5817(2016)05-0327-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.05.001

2016-05-13

上海市科委實驗動物研究專項(13140901300)

楊 倩(1990-), 女, 博士研究生。

E-mail: 13211150008@fudan.edu.cn

共同第一作者: 郁琳(1988-), 女。

E-mail: yulin880507@163.com

何亞萍(1975-), 女, 博士, 副研究員, 從事生殖基礎醫(yī)學研究。E-mail: dhyp409@163.com