劉新國， 程　璐， 楊全偉， 張　耕

（武漢市第一醫(yī)院，湖北武漢430022）

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微透析法研究環(huán)維黃楊星D透皮貼劑透皮吸收行為

劉新國， 程璐， 楊全偉， 張耕*

（武漢市第一醫(yī)院，湖北武漢430022）

摘要：目的 采用微透析法研究環(huán)維黃楊星D透皮貼劑經皮給藥后的藥物動力學行為。方法 線性微透析探針植入Wistar大鼠真皮在線取樣。液相色譜串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）法測定透析液中環(huán)維黃楊星D的回收率與其體內穩(wěn)定性。結果 環(huán)維黃楊星D在0.1～90 ng/mL范圍內線性關系良好（r=0.999 34），定量限為10 pg/mL。透皮貼劑的皮膚局部藥物動力學行為符合單室模型，藥物平均滯留時間在12 h以上。基質藥物質量濃度越高，單位時間透皮量越大，但不呈比例增加。結論 經皮微透析在微創(chuàng)條件下，可滿足環(huán)維黃楊星D透皮貼劑連續(xù)取樣及動態(tài)分析的要求。

關鍵詞：環(huán)維黃楊星D；透皮貼劑；透皮吸收；藥物動力學；微透析；LC-MS/MS

黃楊寧系從黃楊科植物中國小葉黃楊Buxus microPhylla Sieb. et Zucc. var. sinica Rehd. et Wils.及其同屬植物中提取得到的生物堿［1］，其主要有效成分環(huán)維黃楊星D（CVB-D）是《中國藥典》2000年版一部的新增品種，具有行氣活血，通絡止痛的功效，臨床用于治療氣滯血瘀所致的胸痹心痛、脈結代、冠心病、心律失常等［2］。但其靜注后組織親和力強，攝取快，藥物在組織中的潴留時間久，排泄緩慢，導致多次給藥時各臟器出現(xiàn)蓄積現(xiàn)象。根據(jù)環(huán)維黃楊星D的理化性質、藥理特性、藥動學參數(shù)及心血管系統(tǒng)疾病需長期用藥的特點［3］，前期將其研制成經皮給藥貼劑，發(fā)現(xiàn)其黏性適中，皮膚相容性好，具有良好的體外釋藥性和平穩(wěn)的經皮滲透速率［4］。鑒于微透析采樣技術可在基本不干擾生物體內正常生理的情況下，進行在體、實時、在線取樣和檢測，國外利用該技術進行化學單體藥物的體內代謝動力學研究［5-6］，而國內主要針對局部組織的藥物動力學進行［7-8］。本實驗利用微透析線性探針骨性半透膜來模擬皮下毛細血管，聯(lián)合使用液相色譜串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）技術，對環(huán)維黃楊星D經皮給藥后的藥物動力學進行研究。

1 試藥、儀器與動物

1.1 藥品與試劑 環(huán)維黃楊星D對照品（批號888-200001）、多萘哌齊（批號100650-200301）對照品（中國食品藥品檢定研究院）。甲醇為色譜純（德國Merck公司）；醋酸銨為色譜純（美國Dikma公司）；其他試劑均為分析純；純凈水（Purlab classic純水系統(tǒng)制備）。

環(huán)維黃楊星D透皮貼劑（自制，批號20081206，規(guī)格0.1、0.5、1.0 mg/cm2）。制備方法為精密稱取Eudragit E100適量，加入琥珀酸（交聯(lián)劑）和無水乙醇，靜置密閉過夜以使其充分溶解、交聯(lián)，再加入癸二酸二丁酯（增塑劑）和氮酮（促滲劑），混合均勻。精密稱取環(huán)維黃楊星D原料藥適量，無水乙醇溶解，與上述交聯(lián)改性的壓敏膠液混合，攪拌均勻，靜置一段時間以使氣泡消失，涂布于防黏紙上，80℃固化10 min后轉移至背襯層，切割，制成不同載藥量的單層貼劑。

1.2 儀器 Thermo Finnigan TSQ Quantum Ultra型三重四極桿串聯(lián)質譜儀，配備Finnigan Surveyor自動進樣器、電噴霧電離源（ESI源）、Xcalibur 1.3系統(tǒng)控制及數(shù)據(jù)處理軟件（美國Thermo Fisher Scientific公司）；微透析設備，配備MD-2000線性微透析探針（10 mm）、MD 1001灌注器推進泵、MD-0100灌注器（1 mL）、MD 1002灌注器支架、MD-1000流速控制器（美國BAS公司）；高速冷凍離心機（美國Sigma公司）；Precisa XR205SM-DR電子天平（十萬分之一，瑞士普利賽斯公司）。

1.3 試驗動物 健康成年Sprague-Dawley大鼠，體質量（200±20）g，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK（粵）2009-0001。

2 LC-MS/MS法測定環(huán)維黃楊星D的質量濃度

2.1 色譜與質譜條件［9］

2.1.1 色譜條件 Agilent Elipse plus C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流動相60％甲醇（含0.15％甲酸、2 mmol/L乙酸銨）；體積流量0.2 mL/min；柱溫22℃。

2.1.2 質譜條件 大氣壓電噴霧離子（APC-ESI）源，源電壓4.0 kV；加熱毛細管溫度320℃；鞘氣（N2）壓力138 kPa；輔助氣（N2）體積流量5 mL/min；正離子模式檢測，掃描方式為選擇反應監(jiān)測（SRM）；用于定量的離子分別為環(huán)維黃楊星D m/z403（母離子）→372（子離子）、多萘哌齊（內標）m/z 380（母離子）→243（子離子）；掃描時間0.5 s。

2.2 專屬性考察 在“2.2.1”項色譜條件下，環(huán)維黃楊星D的出峰時間在1.20 min左右，而內標峰在1.63 min左右。兩者峰形良好，無雜質峰干擾，基線平穩(wěn)，見圖1～3。由此表明，該方法具有較高的特異性，能準確測定微透析樣品中環(huán)維黃楊星D的質量濃度，靈敏度高。

圖1　空白微透析液加入環(huán)維黃楊星D的質譜圖Fig.1 M ass spectrograms of blanKm icrodialysates added w ith cyclovirobuxine D

圖2　空白微透析液的質譜圖Fig.2 M ass spectrogram s of b lanKm icrodialysates

圖3　未知微透析液的質譜圖Fig.3 M ass spectrograms of unKnown m icrodialysates

2.3 貯備液的配制

2.3.1 環(huán)維黃楊星D對照品貯備液的配制 精密稱取環(huán)維黃楊星D對照品適量，置于100 mL量瓶中，用流動相配成50 μg/mL的溶液，置于4℃冰箱中保存，即得。使用時，用流動相稀釋至所需質量濃度。

2.3.2 內標貯備液的配制 精密稱取多萘哌齊對照品適量，置于100 mL量瓶中，用流動相配成50 μg/mL的溶液，置于4℃冰箱中保存，即得。使用時，用流動相稀釋至所需質量濃度。

2.4 供試品溶液制備 取透析液60 μL，分別加入10 ng/mL內標溶液100 μL，1.2 mol/L氫氧化鈉溶液60 μL，渦旋混勻30 s。再加叔丁基甲醚-二氯甲烷（2∶1）300 μL，渦旋混勻1 min，振蕩10 min，12 000 r/min離心10 min，吸取上層萃取液200 μL，40℃水浴N2吹干，殘渣用60 μL流動相溶解。

2.5 標準曲線制備 取1.5 mL玻璃離心管若干支，分別精密加入環(huán)維黃楊星D對照品及空白透析液適量，渦旋混勻，配成0.1、1、5、10、30、50、90 ng/mL系列樣品，按“2.4”項下方法操作，進樣5 μL分析。以環(huán)維黃楊星D與內標峰的面積比（Ai/As）對環(huán)維黃楊星D的質量濃度（C）回歸，得回歸方程C=13.813 3Ai/As-0.909 70，r=0.999 34，表明環(huán)維黃楊星D在0.1～90 ng/mL范圍內線性關系良好，定量限為10 pg/mL。

2.6 方法回收率及精密度 用空白透析液配制含低、中、高質量濃度（0.5、5、50 ng/mL）環(huán)維黃楊星D的微透析溶液5份，精密吸取60 μL，按“2.4”項下方法操作，進樣測定，記錄環(huán)維黃楊星D和多萘哌齊的峰面積。再配置含3種質量濃度環(huán)維黃楊星D的甲醇溶液，40℃水浴氮氣吹干，殘渣用60 μL流動相溶解，進樣5 μL，記錄兩者峰面積。比較兩種溶液的峰面積，計算環(huán)維黃楊星D回收率和日內RSD。連續(xù)測定3 d，測得日間RSD，結果見表1。

表1　精密度試驗結果Tab.1 Results of precision tests

3 皮膚微透析試驗

3.1 實驗動物 健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠，體質量180～220 g。實驗前適應環(huán)境7 d以上，生活在潔凈環(huán)境中，自由飲水，房間溫度保持在（22±1）℃，相對濕度保持在35％～50％。

3.2 皮膚微透析樣品采集 取大鼠12只，剪去背部絨毛，脫毛膏脫毛后飼養(yǎng)6 d（確保皮膚表面無破損和紅斑水腫）。實驗前，注射25％烏拉坦（0.4 mL/100 g體質量）麻醉，固定于保溫隔墊上，使其體溫保持在37.5℃左右。用特制引導針將線性微透析探針平刺植入皮膚真皮層中（圖4和圖5，平均深度［350±42］μm），引導針抽回，微透析探針膜管留于大鼠皮膚組織中，再將線性微透析探針與微透析裝置相連（圖6）。先以空白灌流液平衡3.0 h后接樣，作為空白透析液。將環(huán)維黃楊星D透皮貼劑（含藥量分別為0.1、0.5、1.0 mg/cm2，給藥面積4 cm×2.5 cm）局部貼敷于探針上部脫毛皮膚，聚乙烯薄膜覆蓋，給藥后1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h收集透析液，LC-MS/MS法測定透析液樣品中環(huán)維黃楊星D質量濃度。

圖4　探針植入皮膚組織圖（100倍）Fig.4 Figure of probe implanted into sKin issue（×100）

圖5　探針植入皮膚組織圖（200倍）Fig.5 Figure of p robe im p lanted into sKin issue（×200）

圖6　經皮微透析照片F(xiàn)ig.6 Photograph of percutaneousm icrodialysis

3.3 探針體內相對回收率穩(wěn)定性考察 藥物動力學研究通常需要較長時間，同一根微透析探針的體內回收率如果在采樣過程中不能保持相對穩(wěn)定，則預測的相對回收率不能用來校正“真實濃度”。因此，實驗前必須對探針體內相對回收率的穩(wěn)定性進行考察。

按“3.2”項下方法操作，采用含藥30％乙醇-林格氏液（100 ng/mL），以1 μL/min的體積流量灌注探針。穩(wěn)定60 min后，以60 min為間隔接收透析液，LC-MS/MS法測定環(huán)維黃楊星D質量濃度，按公式計算體內相對損失率（RL），結果見圖7。

圖7　相對回收率穩(wěn)定性Fig.7 Stability of relative recoveries

由圖可知，體內探針相對損失率在24 h內保持穩(wěn)定（RSD=3.82％），滿足藥物動力學研究的要求。但探針體內外相對損失率并不相等，體內（47.66％）小于體外（49.77％）。

3.4 皮膚局部藥動學參數(shù)及結果分析 按“3.2項”下方法進行皮膚微透析實驗，LC-MS/MS法測定透析液中環(huán)維黃楊星D質量濃度，以當天的標準曲線計算而得，并同時測定質控樣本。然后，以體內相對回收率校正得到真實值，計算公式如下。

透皮貼劑皮膚給藥后，計算各時間點皮下環(huán)維黃楊星D質量濃度，藥物動力學曲線見圖8。

圖8　濃度-時間曲線Fig.8 Concentration-time curves

藥物動力學參數(shù)通過Winnonlin軟件計算，曲線下面積（AUC）采用梯形面積法計算，以AIC最小值為隔室模型判斷標準，環(huán)維黃楊星D透皮貼劑皮膚局部藥物動力學過程符合單室模型，權重為uniform weight，參數(shù)見表2，結果見表3。

表2　房室模型擬合的藥物動力學參數(shù)Tab.2 PharmacoKinetic parameters fitted w ith com partmentmodel

從表可知，環(huán)維黃楊星D透皮貼劑的藥物平均滯留時間在12 h以上，透皮效果持久。藥物透皮量可用AUClast來反映，而單位時間內平均透皮量可用AUClast/MRTlast表示，基質藥物質量濃度越高，單位時間內透皮量越大，但不呈等比例增加。因此，壓敏膠中藥物質量濃度并非是決定貼劑透皮速率的唯一因素，包括制劑處方因素在內，影響貼劑中藥物釋放各因素之間的相互作用可能才是決定藥物透皮效果的關鍵環(huán)節(jié)。

表3　非房室模型擬合的藥物動力學參數(shù)Tab.3 PharmacoKinetic parameters fitted w ithout compartmentmodel

4 討論

微透析探針有很多種，本實驗采用線性微透析探針，其探頭包括雙層管，外周裹著一層油性管，中間部分有個“窗口半透膜”，有著增加探針穩(wěn)定性、保證半透膜進入或退出組織等作用。探針的入口處有一個Luer Lock連接器，以鏈接匹配的注射器或鏈接微蠕動泵輸入透析液，另一端則用于接收含藥透析液。

探針整體模擬皮下毛細血管時，僅允許小于半透膜膜孔的分子進入或輸出。故需要用一個引導針植入真皮層，然后緩慢輸入（0.5～4.0 μL/min）灌流液來與外周組織液產生輸入-輸出的動態(tài)平衡，用于交換小于半透膜截斷值的物質。物質的質量濃度梯度交換基于Fick's第二法則，而平衡速度則與藥物的擴散率及質量濃度梯度大小有關［10］。

綜上所述，環(huán)維黃楊星D透皮貼劑的皮下藥物動力學行為與體外透皮結果之間存在一定相關性［4］。經皮微透析能在微創(chuàng)的條件下，滿足定性、定量、定位、連續(xù)取樣及動態(tài)分析的研究要求，可為經皮給藥的藥物動力學研究，以及相關藥物的質量評價提供可靠和全新的手段［11］。

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Percutaneous absorption behavior of cyclovirobuxine D transdermal patch by m icrodialysis

LIU Xin-guo， CHENG Lu， YANG Quan-wei， ZHANG Geng*
（Wuhan MuniciPal No.1 HosPital，Wuhan 430022，China）

ABSTRACT：AIM To study the pharmacokinetic behavior of cyclovirobuxine D transdermal patch after percutaneous administration by microdialysis.M ETHODS A linearmicrodialysis probe was implanted into Wistar rats' dermis for continuous sampling.The recovery rate of cyclovirobuxine D in dialysate and its stability in vivo were determined by liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）.RESULTS Cyclovirobuxine D showed a good linear relationship within the range of 0.1 -90 ng/mL（r=0.999 34），whose limit of quantification was10 pg/mL.The pharmacokinetic behavior of transdermal patch in local skin accorded with single compartmentmodel，and the average residence time of drug wasmore than 12 h.The higher concentration ofmatrix drug permitted a greater percutaneous amount per unit time，but not proportionally.CONCLUSION Minimally invasive，subcutaneousmicrodialysis can satisfy the continuous sampling and dynamic analysis for cyclovirobuxine D transdermal patch.

KEY WORDS：cyclovirobuxine D；transdermal patch；percutaneous absorption；pharmacokinetics；microdialysis；LC-MS/MS

*通信作者：張 耕，男，碩士，主任藥師，從事藥物新制劑、新技術研究與醫(yī)院藥學管理工作。Tel：（027）61871268

作者簡介：劉新國，男，博士，主管中藥師，從事醫(yī)院藥物制劑的研究與開發(fā)。Tel：13628661063，E-mail：lxgdata@126.com

收稿日期：2015-10-19

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.009

中圖分類號：R969.1

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）05-1006-05