劉晨

摘 要：金屬硫蛋白通常由α和β兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，其中α的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成包括Cd2+和Hg2+，小鼠突變體則在大腸桿菌中進(jìn)行搭建，并獲得了轉(zhuǎn)基因植株。為了更好地增強(qiáng)外源基因在煙草中的表達(dá)效果，可以在基因起始密碼子ATG附近融入適合植物需要的堿基組合AACAATG，這種組合有利于將突變體基因插入具有35S強(qiáng)啟動(dòng)子的植物雙元表達(dá)載體pGPTVd35S-BAR中，并獲得αα突變體的植物雙元表達(dá)載體。在本次研究中，將采用PCR-Southern和蛋白Dot-blotting檢測(cè)方法，證明αα突變體可以在煙草中良好地表達(dá)。同時(shí)，在抗重金屬的實(shí)驗(yàn)中證明轉(zhuǎn)基因煙草能夠在Cd400中良好的生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞：金屬硫蛋白突變體 植物高效表達(dá)載體 煙草 轉(zhuǎn)基因

中圖分類(lèi)號(hào)：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2016）4（c）-0000-00

現(xiàn)階段，我國(guó)植物基因工程技術(shù)得到了全面的發(fā)展，外源基因通過(guò)不同的方法進(jìn)入植物體中。尤其是使用轉(zhuǎn)入外源基因的方式能夠有效地提高植物吸附重金屬的能力，有利于解決環(huán)境污染問(wèn)題。在工農(nóng)業(yè)文明持續(xù)發(fā)展的過(guò)程中，廢水、廢氣、廢渣及農(nóng)藥的不合理使用對(duì)環(huán)境資源造成了嚴(yán)重的損害，其中重金屬污染主要以Cd2+、 Hg2+、Pb2+為主。它們?cè)谑澄镦湹难h(huán)過(guò)程中將會(huì)影響人類(lèi)的生命健康。除此之外，在自然界中金屬硫蛋白（MT）發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，這也是本文探討的主要方向。

1 金屬硫蛋白的基本概念

金屬硫蛋白是一類(lèi)低分子量富含半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白，可以結(jié)合排除體內(nèi)過(guò)量的重金屬物質(zhì)。與此同時(shí)，在植物界存在一類(lèi)多肽物質(zhì)，即植物絡(luò)合態(tài)，它是一種酶促合成的產(chǎn)物，在重金屬大量存在的時(shí)候會(huì)有全新的表達(dá)。除此之外，植物本身對(duì)重金屬的抵抗能力是有限的，需要通過(guò)植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)將金屬硫蛋白基因轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)。

金屬硫蛋白通常由α和β兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，其中α的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成包括Cd2+和Hg2+，在構(gòu)建MT重組體αα的過(guò)程中，其中β結(jié)構(gòu)域被α結(jié)構(gòu)域所代替，通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們認(rèn)為αα的穩(wěn)定性與天然MT相同。因此，當(dāng)我們?cè)诳紤]將αα轉(zhuǎn)基因放入植物體內(nèi)時(shí)，可以優(yōu)化植物對(duì)重金屬的承受力。在該方面的研究中，我們認(rèn)為重金屬的含量與植物體內(nèi)的αα基因的蛋白量成正相關(guān)關(guān)系，并證實(shí)了轉(zhuǎn)入αα基因的煙草對(duì)Cd2+有較好的抵抗性。

2 金屬硫蛋白突變體的植物高效表達(dá)載體的實(shí)驗(yàn)探究

2.1 材料與方法

本次實(shí)驗(yàn)我們選取了含有小鼠MT重組體的αα基因cDNA質(zhì)粒pBSαα、質(zhì)粒pUC18、農(nóng)桿菌LBA4404、helper質(zhì)粒pRK2013，在酶和試劑的選擇上包括EcoRⅠ、HindⅢ、XbaⅠ、SacⅠ、T4 DNA ligase等。

其探究方法包括以下幾個(gè)步驟。首先，我們需要將PCR擴(kuò)增αα基因，即以pBSαα為模板，得到PCR后加入突變位點(diǎn)的ααcDNA基因。隨后需要搭建pUC18αα測(cè)序載體，并使用baⅠ/SacⅠ雙酶切去磷酸化，保存，2%片段進(jìn)行定向克隆到酶切過(guò)的pUC18中完成酶切鑒定。與此同時(shí)，搭建植物高效表達(dá)式載體，將準(zhǔn)備好的35 S的質(zhì)粒pBI426及植物表達(dá)載體pGPTV-BAR用EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切，在去磷酸化之后完成酶切篩選。值得注意的是，在該載體搭建的過(guò)程中需要按照正確的測(cè)序順序進(jìn)行，并搭建與pGPTVd35S載體相同的酶XbaⅠ/SacⅠ酶切。除此之外，我們還要對(duì)含有αα轉(zhuǎn)基因的植株和PCR進(jìn)行PCR-Southern鑒定，即通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草NC89獲得抗除草劑植株，并提取煙草葉DNA，在分離純化之后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。最后，我們將完成對(duì)含有αα基因的轉(zhuǎn)基因植株的蛋白Dot-blot鑒定。具體為：將葉片經(jīng)液氮處理并研磨成粉末，并研制成漿液，取清液Bio-Rad點(diǎn)樣器點(diǎn)樣于NC膜上，取總蛋白量100μg上清點(diǎn)樣于孔中，隨后抽濾為真空狀態(tài)，進(jìn)行抗體抗血清反應(yīng)。

2.2 結(jié)果

在 PCR產(chǎn)物的酶切及鑒定上，由于αα為兩個(gè)重復(fù)的片段，所以出現(xiàn)了兩條帶。在PCR回收的片斷XbaⅠ/SacⅠ雙酶切后進(jìn)行了藍(lán)白斑的篩選，且酶切結(jié)果顯示為陽(yáng)性克隆。隨后，完成35S啟動(dòng)子植物表達(dá)載體的構(gòu)建，具體表達(dá)如圖1所示。

圖1 35S啟動(dòng)子植物表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖

與此同時(shí)，在轉(zhuǎn)基因植株的PCR、PCR-Southern鑒定上，我們提取了煙草葉的DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)展，以αα的兩端為5和3引物，其反應(yīng)體系可為25?I。引起該反應(yīng)的基本條件為96℃ 5 min，94℃ 5 min，60℃ 1 min，72℃ 2 min為一個(gè)循環(huán)，然后進(jìn)入30個(gè)循環(huán)； 94℃ 1 min，60℃ 1min，72℃ 2 min，最后72℃延伸10 min。這是由于αα是重復(fù)的基因，在PCR時(shí)得到的兩條帶分別為119bp和215bp。當(dāng)我們對(duì)該片段進(jìn)行稀釋后可使用1.5%瓊脂糖膠分離轉(zhuǎn)尼龍膜，完成雜交過(guò)程。

在轉(zhuǎn)基因植株抗性實(shí)驗(yàn)上，每種濃度的試劑都有6-8棵植株樣本，并進(jìn)行為期30天的觀察。具體而言，需要將培養(yǎng)的生根植株移栽到不同濃度梯度的Cd2+培養(yǎng)容器中，經(jīng)過(guò)30天的培養(yǎng)，Cd200的培養(yǎng)容器內(nèi)轉(zhuǎn)基因煙草的生長(zhǎng)狀態(tài)顯示為正常；Cd300的轉(zhuǎn)基因植株其內(nèi)根系相對(duì)正常，但是比起Cd200的植株根系較為短粗；Cd400的轉(zhuǎn)基因煙草的根系少數(shù)顏色為褐色，且葉片輕微發(fā)黃，總體生長(zhǎng)正常。對(duì)照煙草植株的根系在Cd200時(shí)就無(wú)法正常生存。

2.3 討論

使用PCR方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探究，并以pBS-αα為模板得到了起始密碼子ATG前加上AACA四個(gè)堿基的突變體基因。通過(guò)裝入測(cè)序載體驗(yàn)證了序列的正確性。因此，我們認(rèn)為提高外源基因在植物體中的表達(dá)，建立高效的表達(dá)載體和較強(qiáng)的啟動(dòng)子具有重要的參考價(jià)值。即在pGPTVd35S表達(dá)載體構(gòu)建的過(guò)程中，Gus npt基因的上游有兩個(gè)串聯(lián)的35S啟動(dòng)子和AMV序列，下游則是Nos終止子。除此之外，該載體還包含了Pnos啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的bar基因。綜上所述，我們認(rèn)為轉(zhuǎn)基因煙草可以用除草劑來(lái)進(jìn)行初步篩選。當(dāng)我們利用XbaⅠ/SacⅠ切掉Gus npt基因后，插入測(cè)序正確的αα突變體基因時(shí)便得到了植物雙元表達(dá)載體。根據(jù)雙子葉植物的密碼子，改變堿基，并將密碼子的使用頻率由原先的44%提升到56%，5引物中的原TGT改為T(mén)GC，3引物中原AGG改為現(xiàn)在的AGT，證明了啟動(dòng)子強(qiáng)弱對(duì)外源基因表達(dá)有直接影響，且處于關(guān)鍵位置。與此同時(shí)，植物對(duì)堿基的偏愛(ài)主要受到特定堿基組合的干擾，即可以提高mRNA的穩(wěn)定性以及蛋白翻譯的起始頻率。此外，在優(yōu)化高效表達(dá)的過(guò)程中，我們進(jìn)行了以下三部分的調(diào)整，包括：轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控35S-35S；轉(zhuǎn)譯水平的調(diào)控AMV基因的5-非轉(zhuǎn)譯序列；轉(zhuǎn)譯水平調(diào)控改變ATG附近位置的堿基組成。

3 結(jié)語(yǔ)

本文綜合考慮了影響植物體的多種因素，優(yōu)化各項(xiàng)條件和環(huán)境，從而搭建了αα突變體基因的植物高效表達(dá)載體，并成功獲得了轉(zhuǎn)基因植株。在初步檢驗(yàn)的過(guò)程中有效地證明了外源基因已嵌合。對(duì)于已經(jīng)生根的植株的移植方面，說(shuō)明在Cd400的培養(yǎng)濃度下可以正常地生長(zhǎng)，其它的抗性實(shí)驗(yàn)仍有很大的發(fā)展空間。

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