謝軼 蘇冰霞 周鵬

摘 要 通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，使用高效液相色譜法對(duì)海南省種植范圍較廣的幾種番木瓜（中白、大青、小青）維生素C（Vc）含量進(jìn)行測定。選取3個(gè)番木瓜品種成熟果實(shí)，通過HPLC方法測定Vc的標(biāo)準(zhǔn)溶液線性、精密度、回收率等，并比較該法與國標(biāo)方法的重復(fù)性。結(jié)果顯示，獲得線性回歸方程y=35.41x-4.16（r=0.999），Vc在 60～300 μg/mL 的濃度范圍線性關(guān)系良好，方法回收率為98.56%～103.21%，精密度RSD為0.69%；測得中白、大青、小青果肉Vc含量分別為49.12、43.38、46.31 mg/hg。HPLC法結(jié)果重現(xiàn)性RSD為0.68%；2，6-二氯靛酚滴定法結(jié)果重現(xiàn)性RSD為5.45%，表明HPLC法是檢測番木瓜等深顏色水果Vc含量可靠的方法。

關(guān)鍵詞 番木瓜 ；維生素C ；高效液相色譜

分類號(hào) S668.2 Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.02.010

An Optimized HPLC Method for Analyzing

Vc Content in Different Breeds of Papaya

XIE Yi1，2） SU Bingxia1，2） ZHOU Peng1，2）

（1 Analysis & Testing Center， CATAS，Haikou，Hainan 571101；

2 Hainan Provincial Key Laboratory of Quality and Safety for Tropical Fruits and Vegetables，

Haikou， Hainan 571101）

Abstract In order to develop an optimal method for isolating and analyzing Vc in breeds of papaya which were widely planted. extracting solution，chromatographic conditions were improved and optimized on the basis of former reported High Performance Liquid Chromatography（HPLC） methods. The results showed that The calibration curves of Vc was in good linearity over the ranges of 60～300 μg/mL（r=0.999）， and the average recovery rates was 100.75% （RSD=0.69%）. The content of Vc in "Zhongbai"，"Daqing"， "Xiaoqing" is 49.12， 43.38， 46.31 mg/100 g. The method of HPLC is better in repeatability（RSD=0.68%） than 2，6-dichlorindophenol titration（RSD=5.45%）. Therefore HPLC could be used for the determination of Vc in papaya and other fruits which had high level of Vc.

Keywords papaya ； Vc ； HPLC

維生素C是維持人體生理機(jī)能的重要營養(yǎng)素，是人體需求量最大而又自身無法合成，必須從外界攝取的一類維生素。研究表明，Vc還具有抗癌、抗氧化作用[2-3]。番木瓜中維生素C的含量是蘋果的20～30倍[1]，半個(gè)中等大小的番木瓜足以供成人整天所需的維生素C。因此，準(zhǔn)確測定番木瓜中Vc含量，對(duì)番木瓜資源的開發(fā)利用有十分重要的意義。

傳統(tǒng)的紫外分光光度分析法[4]、碘量法[5]、2，4-二硝基苯肼比較法[6]等存在操作繁瑣、費(fèi)時(shí)、結(jié)果不準(zhǔn)確等問題，常用的國標(biāo)方法（2，6-二氯靛酚滴定法）對(duì)深色水果突變終點(diǎn)顯色不明顯，造成結(jié)果誤差大等問題。用高效液相色譜法測定水果中 Vc 含量已較為常見[7-9]。本研究采用HPLC方法檢測3種番木瓜Vc含量，并用2，6-二氯靛酚滴定法對(duì)該法的結(jié)果重現(xiàn)性進(jìn)行比對(duì)，建立了較為快速準(zhǔn)確的測定番木瓜Vc含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器

METTLER TOLEDO 電子天平；Waters alliance e 2695液相色譜儀；Waters XBridge C18色譜柱。

1.1.2 試劑

Vc 標(biāo)準(zhǔn)品（分析純含量>99.0%，上海生工生物工程公司）；草酸、偏磷酸（MPA）均為分析純；水為去離子水；2，6-二氯靛酚鈉、白陶土（上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司）；新鮮番木瓜（基地采樣）。

1.2 方法

1.2.1 Vc標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

精確稱取Vc對(duì)照品100 mg于 50 mL 棕色容量瓶中，用0.1% 草酸流動(dòng)相定容，配成 2 000 μg/mL 的對(duì)照品溶液，待用。

1.2.2 供試品溶液的制備

將各品種番木瓜去皮、去籽，分別取50 g果肉，加50 mL 2%草酸浸提劑，迅速研磨成勻漿，用布氏漏斗過濾后置于100 mL容量瓶中，定容，最后用0.45 μm濾膜過濾，即得供試品溶液。2，6-二氯靛酚滴定法制樣參見國家標(biāo)準(zhǔn)[1]。

1.2.3 色譜條件

HPLC色譜柱：Waters XBridge C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：0.1% 草酸溶液；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；紫外檢測器檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.4 線性關(guān)系測定

分別準(zhǔn)確吸取 Vc 對(duì)照品溶液 1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 mL于50 mL 棕色容量瓶中，用流動(dòng)相溶液將其稀釋至刻度，搖勻，分別配成 60、120、180、240、300 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。按“1.2.3”中色譜條件，采用HPLC法測定各標(biāo)準(zhǔn)液的峰面積，記錄色譜圖。

1.2.5 “中白”樣品測定

取同批“中白”供試品溶液，按“1.2.3”的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣 6 次，采用HPLC法檢測。

1.2.6 方法重復(fù)性比對(duì)

HPLC法重復(fù)性測定：取同批“中白”番木瓜樣品，按照“1.2.2”的制樣方法制備供試品溶液，準(zhǔn)確稱5份，按“1.2.3”的色譜條件測定，通過計(jì)算 RSD來考查其方法的重復(fù)性。

2，6-二氯靛酚滴定法重復(fù)性測定：具體操作方法參見國家標(biāo)準(zhǔn)[1]。

1.2.7 回收率測定

用移液器吸取等量“中白”樣品溶液至相應(yīng)編號(hào)的容量瓶中，在已知濃度的樣品中分別準(zhǔn)確加入50、100、150、200、250 μg的標(biāo)準(zhǔn)品，采用HPLC法依次進(jìn)行峰面積測定。

1.2.8 提取液的選擇

取5份“中白”番木瓜并分為2組，分別以2%草酸和2%偏磷酸作為樣品提取液，參照“1.2.2”的方法制樣；檢測方法參照“1.2.3”，分別以0.1%草酸[10]和0.2%MPA[11]作為流動(dòng)相測定Vc含量。

1.2.9 3個(gè)番木瓜品種的Vc含量

通過實(shí)地調(diào)研，選取海南普遍種植的3個(gè)番木瓜品種（中白、大青、小青），從海南昌江、東方、三亞基地分別摘取這3個(gè)品種的成熟番木瓜，按照“1.2.2”方法，分別制得6份待測樣品，按照“1.2.3”的色譜條件，用HPLC法檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系分析

以峰面積對(duì)濃度求回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見圖1。得到線性回歸方程y=35.41x-4.16（r=0.999），Vc含量在 60～300 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 樣品測定及精密度

由表1可知，“中白”Vc含量平均值為49.17 mg/hg，標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.69%，表明HPLC法精密度良好。

2.3 重復(fù)性比對(duì)

結(jié)果表明，HPLC法重現(xiàn)性良好，RSD為0.68%；國標(biāo)方法2，6-二氯靛酚滴定法測得的RSD為5.45%（表2）。從表2的數(shù)據(jù)可知，HPLC法測定的Vc數(shù)據(jù)穩(wěn)定，重現(xiàn)性明顯優(yōu)于滴定法。分析原因如下：其一，番木瓜為深顏色果肉，雖通過高嶺土褪色，但仍有殘留底色，并且通過脫色過濾，延長了Vc溶液的處理時(shí)間，容易造成Vc氧化損失；其二，滴定法通過肉眼觀察顏色突變終點(diǎn)，勢必會(huì)存在人為誤差。故HPLC法更能客觀準(zhǔn)確地測定Vc含量。

2.4 回收率分析

將測得的峰面積帶入回歸方程y=35.41x-4.16（r=0.999），得到各組Vc含量，經(jīng)計(jì)算得到回收率，結(jié)果見表3。方法回收率在98.56%～103.21%，平均回收率為100.75%，RSD為0.68%?；厥章瘦^穩(wěn)定，說明采用HPLC法測定番木瓜Vc含量數(shù)據(jù)可靠。

2.5 提取液的選擇

結(jié)果表明，這2種提取液對(duì)Vc含量的測定沒有明顯影響（表4），說明草酸和偏磷酸均可作為較好的抑制劑阻止Vc氧化。但由于偏磷酸遇熱不穩(wěn)定，本研究選擇2%草酸作為樣品浸提劑。液態(tài)Vc有較強(qiáng)的還原性，在酸性溶液中較穩(wěn)定，為保證在整個(gè)測試過程中Vc呈現(xiàn)較穩(wěn)定的狀態(tài)，故流動(dòng)相應(yīng)保持酸性。本研究選用0.2% MPA水溶液及0.1%草酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行測試，結(jié)果均呈單峰且出峰快。出于與浸提劑一致性考慮，本研究選擇0.1%草酸作為相關(guān)實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相。

2.6 不同品種番木瓜果實(shí)中Vc含量比較

通過對(duì)海南常見的3個(gè)番木瓜品種Vc含量的測定，發(fā)現(xiàn)這3種番木瓜品種Vc含量總體差異不大，含量從高到低依次為中白、小青、大青（表5）。

3 討論與結(jié)論

利用全波長掃描Vc標(biāo)準(zhǔn)溶液，發(fā)現(xiàn)在254 nm處有最大吸收值，因此選擇254 nm作為色譜的檢測波長。本研究結(jié)果表明，HPLC法線性范圍較寬，線性關(guān)系良好，說明在測試過程中，Vc受環(huán)境干擾少；通過重復(fù)性測試可知，HPLC法的RSD為0.68%，說明該方法重現(xiàn)性好，結(jié)果穩(wěn)定、可靠，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)滴定法，大大減少了肉眼觀察滴定終點(diǎn)的誤差，提高了測定的準(zhǔn)確度。HPLC法的回收率為98.56%～103.21%，說明該方法準(zhǔn)確、可靠。綜上所述，采用高效液相色譜法測定番木瓜中Vc含量具有選擇性好、靈敏度高、操作簡單、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，是測定Vc含量的理想方法。本研究測定了海南常見的3個(gè)番木瓜品種果實(shí)的Vc含量，發(fā)現(xiàn)這3個(gè)番木瓜品種Vc含量總體差異不大，從高到低依次為中白、小青、大青。本研究結(jié)果可為喜好生食番木瓜的民眾提供一定的參考價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

[1] 國家標(biāo)準(zhǔn)局. GB 6195-86 水果、蔬菜維生素C含量測定法（2，6-二氯靛酚滴定法）[S]. 1986-01-18.

[2] 周 鵬，沈文濤. 番木瓜生物技術(shù)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011：1-177.

[3] Jacobs E J， Connell C J， McCullough M L， et al. Vitamin C， vitaminE， and multivitamin suppelment use and stomach cancer mortality in the Cancer Prevention Study II cohort[J]. Cancer Ep idemiolBi2 omarkers Prev， 2002， 11 （1）： 35 241.

[4] 周德慶，韓雅珊. 紫外分光光度法快速測定果蔬及飲料中維生素C含量的研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，2（5）：7-13.

[5] 易靈紅，戴麗艷. 黃瓜中維生素C含量的測定[J]. 廣東化工，2012，39（6）：181-182.

[6] 中華人民共和國衛(wèi)生部. GB/ T 5009.86-2003 蔬菜、水果及其制品中總抗壞血酸的測定（熒光法和2，4二硝基苯肼法）[S]. 2004-01-01.

[7] 安華明，劉 明，楊 曼，等. 刺梨有機(jī)酸組分及抗壞血酸含量分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（10）：2 094-2 100 .

[8] 孫艷麗. 高效液相色譜法測定果粒橙中維生素C的含量[J]. 廣東化工，2013，40（1）：105-06 .

[9] 郝學(xué)寧，郝嬙嬙，劉雪蓮. HPLC 法測定果蔬中維生素C[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011（3）：30-31.

[10] 劉嘉祺，孫仁國，李 磊. 高效液相色譜法測定芒果中的VC含量[J]. 中國食物與營養(yǎng)，2013，19（12）： 66-68.

[11] 王樂樂，安華明. HPLC 測定刺梨果實(shí)中維生素C含量方法的優(yōu)化[J]. 現(xiàn)代食品科技，2013，29（2）： 397-400.