徐麗　陳新　魏海蓉　張力思　宗曉娟　王甲威　朱東姿　譚鉞　劉慶忠

摘要：本研究以9份核桃屬種質(zhì)資源為材料，利用設(shè)計(jì)引物對(duì)其ITS區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序。利用Dnasp 5.0和MEGA 6.0軟件分析ITS序列特征，尋找差異位點(diǎn)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，9份材料的ITS區(qū)段在644～647 bp之間，存在48個(gè)變異位點(diǎn)，轉(zhuǎn)換和顛換的比值為1.75。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，野核桃和核桃楸親緣關(guān)系最近，最先聚在一起，再與麻核桃聚為核桃楸組，與傳統(tǒng)分類學(xué)一致。本研究為發(fā)掘和利用核桃屬種質(zhì)資源奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：核桃屬；ITS序列；序列分析

中圖分類號(hào)：S664.102.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001—4942（2016）03—0001—04

我國(guó)是核桃屬（Juglans）植物的起源和分布中心之一，核桃種質(zhì)資源豐富，分布廣泛。全世界核桃屬植物約有23個(gè)種，原產(chǎn)我國(guó)的有5個(gè)種，即核桃（J.regia L.）、野核桃（J.cathayensis Dode）、核桃楸（J.MANDSHURICA mAXIM.）、麻核桃（J.hopeien-sis Hu）和鐵核桃（J.sigllata Dode）。核桃屬中多數(shù)成員為重要的種質(zhì)資源，有食用、藥用和材用等價(jià)值。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA分子水平的遺傳標(biāo)記被廣泛用于解決系統(tǒng)發(fā)育、基因資源保護(hù)和遺傳育種中的問(wèn)題。其中利用ITS序列及其二級(jí)結(jié)構(gòu)闡述核桃屬之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系是一種有效的方法。ITS序列是介于18S和28S之間的非編碼轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)。在被子植物中，ITS序列長(zhǎng)度在500～700 bp之間，而在裸子植物中，ITS序列長(zhǎng)度在1500～3700 bp之間。ITS序列進(jìn)化速度非?？欤窃诜N、屬和科水平上構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹的有效工具。ITS1位于18S和5.8S之間，在種及種以下水平非常有價(jià)值。ITS2位于5.8S和28S之間，被證明在更高級(jí)生物分類學(xué)水平上包含有價(jià)值的生物學(xué)信息。ITS序列可用于了解物種系統(tǒng)發(fā)育史和多倍體祖先、基因組同源性、基因滲透和其它進(jìn)化問(wèn)題。ITS序列和5.8S rDNA已被成功用于研究核桃屬系統(tǒng)發(fā)育和生物地理關(guān)系。

本研究對(duì)9份核桃種質(zhì)資源的ITS序列進(jìn)行比較，分析其序列特征，探討核桃屬植物的遺傳變異情況及其親緣關(guān)系，為其系統(tǒng)生物學(xué)研究提供資料。

1材料與方法

1.1材料

供試核桃種質(zhì)資源9份，保存在山東泰安國(guó)家核桃板栗資源圃，分別為香玲（J.regia L.）、云新（J.sigllata D.×J.regia L.）、核桃楸（J.mandshu-rica Maxim.）、泰山野核桃（J.cathayensis Dode）、獅子頭（J.hopeiensis Hu）、雞心（J.hopeiensis Hu）、小果黑核桃（J.microcarpa Engelm）、北加州黑核桃（J.hindsii）和魁核桃（J.major Heller）。取新鮮葉片液氮速凍后保存于-80℃冰箱備用。

1.2基因組DNA提取

采用植物基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取各材料總DNA。

1.3 ITS區(qū)序列擴(kuò)增和測(cè)序

根據(jù)GenBank上發(fā)表的核桃屬ITS序列設(shè)計(jì)特異引物，上游引物P1：5′-AAGTCGTAACAAG-GTITCCGTAG-3′和下游引物P2：5′-GCCCGCT-TATFGATATGCTFAAAT-3′。以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性40 s，55℃退火50 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后用DNA回收試劑盒回收目的片段，連接pBLUE載體，轉(zhuǎn)化E. coliDH5a，篩選陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.4 ITS區(qū)序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

測(cè)序結(jié)果采用DNAMAN軟件校對(duì)拼接，然后進(jìn)行BLASTN（Nucleotide BLAST）比對(duì)，確定所獲序列。利用MEGA 6.0軟件中鄰接法（Neighbour-joining method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap（重復(fù)1000次）檢驗(yàn)各分支支持率。運(yùn)用Dnasp5.0進(jìn)行堿基組成、變異位點(diǎn)數(shù)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)、轉(zhuǎn)換和顛換數(shù)等分析。

2結(jié)果與分析

2.1 ITS序列擴(kuò)增及序列信息

以9份核桃種質(zhì)資源的基因組DNA為模板，P1和P2為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，在750 bp處出現(xiàn)特異性條帶，片段大小與預(yù)測(cè)值基本一致。對(duì)各樣品的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列拼接，獲得ITS區(qū)序列。將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLASTN比對(duì)，其核苷酸序列均與核桃屬ITS區(qū)序列具有較高的相似性，同源性均達(dá)到95%以上。HMMer注釋法得到9份種質(zhì)資源以“TTGTCG”為始端、以“GCGAGC”為末端的ITS區(qū)序列全長(zhǎng)。9份核桃的ITS區(qū)序列長(zhǎng)度在644～647 bp之涉及，G+C占55.43%～56.57%。其中ITS1序列長(zhǎng)263～266 bp，G+C含量為54.55%～55.64%；5.8S rDNA序列長(zhǎng)162bp，G+C含量為54.94%；ITS2序列長(zhǎng)219 bp，G+C含量為56.62%～59.36%（表1）。公認(rèn)的核桃科ITS1和ITS2序列之間的G+C含量是穩(wěn)定的，高GC含量與保持DNA和RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)特別是莖一環(huán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性是相關(guān)的。

2.2 ITS序列變異分析

ITSl和ITS2序列變異分析包括轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失。Dnasp 5.0軟件分析顯示，9份核桃種質(zhì)資源ITS序列位點(diǎn)中不變位點(diǎn)數(shù)為604，變異位點(diǎn)數(shù)為48，多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)（Polymorphic sites）為39，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)（Parsimony informative sites）為32。核苷酸多樣性（Nucleotide diversity）Pi值為0.02886，Theta值為0.02747，序列之間的一致性達(dá)97.60%。ITSl區(qū)存在TAA插入、A插入和G缺失，ITS序列轉(zhuǎn)換和顛換的比值為1.75（表2）。

2.3供試核桃種質(zhì)材料間的遺傳距離及系統(tǒng)發(fā)育分析

應(yīng)用MEGA 6.0進(jìn)行序列分析，根據(jù)ITS1-5.8S-ITS2核苷酸序列，運(yùn)用鄰接法（NJ）構(gòu)建9份核桃種質(zhì)資源的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。結(jié)果表明，魁核桃、小果黑核桃和北加州黑核桃聚為一類，香玲和云新聚為一類，而泰山野核桃、核桃楸、獅子頭和雞心聚為一類，與傳統(tǒng)分類學(xué)一致。3結(jié)論與討論

ITS序列是位于18S-5.8S-28S之間的轉(zhuǎn)錄間隔序列，具有高拷貝性。由于其長(zhǎng)度的保守性和核苷酸序列的高度變異以及各重復(fù)單元間協(xié)同進(jìn)化的特性，ITS已經(jīng)成為在DNA水平上探討物種系統(tǒng)進(jìn)化及進(jìn)行多樣性研究的有效手段。本研究用Dnasp軟件分析了9份核桃種質(zhì)資源的ITS序列及其包含的不變位點(diǎn)、變異位點(diǎn)、多態(tài)性位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)等，結(jié)果表明不同核桃種質(zhì)資源的ITS序列存在較多的變異位點(diǎn)，可作為區(qū)分核桃種質(zhì)資源的有效工具。供試核桃種質(zhì)材料ITS核苷酸多樣性的Pi值和Theta值均很低，說(shuō)明核桃屬ITS不存在假基因現(xiàn)象，符合被子植物ITS協(xié)同進(jìn)化規(guī)律。

關(guān)于野核桃和核桃楸的系統(tǒng)分類地位一直存在爭(zhēng)議，《中國(guó)植物志》將野核桃和核桃楸定為2個(gè)種；《Flora of China》根據(jù)兩者形態(tài)相似性，將野核桃歸類到核桃楸中；國(guó)外研究者基于形態(tài)學(xué)與遺傳標(biāo)記的分析支持野核桃與核桃楸為2個(gè)種的觀點(diǎn)。麻核桃的系統(tǒng)發(fā)育地位也一直存在爭(zhēng)議，《中國(guó)植物志》將麻核桃歸為核桃屬的核桃楸組；RAPD分子標(biāo)記對(duì)麻核桃系統(tǒng)地位的分析結(jié)果顯示，核桃楸×核桃的天然雜交是麻核桃形成的主要機(jī)制，在麻核桃的起源中，核桃楸的遺傳貢獻(xiàn)率大于核桃，結(jié)果贊成傳統(tǒng)分類學(xué)對(duì)麻核桃分類地位的劃分。本研究通過(guò)分析9份核桃種質(zhì)資源的ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，9份材料主要分為兩大類，小果黑核桃、北加州黑核桃和魁核桃先聚為一類再與香玲和云新聚為一大類；泰山野核桃與核桃楸先聚為一類，再與麻核桃（獅子頭和雞心）聚為一大類。說(shuō)明野核桃和核桃楸親緣關(guān)系最近，最先聚在一起。ITS測(cè)序結(jié)果也顯示泰山野核桃和核桃楸存在相同的插入和缺失，兩種間有99%的堿基相同，由此可見核桃楸和野核桃之間的親緣關(guān)系的確非常近。本研究結(jié)果傾向于認(rèn)為這兩個(gè)種是為了適應(yīng)環(huán)境變化而產(chǎn)生的不同地理生態(tài)類型。聚類分析還顯示野核桃、核桃楸和麻核桃最終聚在一起形成核桃楸組，這與傳統(tǒng)分類學(xué)一致，也進(jìn)一步證明核桃楸對(duì)麻核桃形成的遺傳貢獻(xiàn)率大于核桃。