李敏玲　陳富美　廖碧云　潘宏　黃德倫　黃鳳玲　陸陽清　張明

摘要：【目的】探討表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對水牛卵母細胞體外成熟質量與早期胚胎發(fā)育能力的影響，為優(yōu)化水牛體外胚胎生產體系及提高其體外胚胎生產效率提供參考?！痉椒ā吭谒Ｂ涯讣毎w外成熟液中添加不同濃度的EGCG，以排出第一極體為細胞核成熟標志，觀察卵母細胞核成熟情況，檢測MII期卵母細胞內活性氧（ROS）和谷胱甘肽（GSH）含量，并統(tǒng)計經孤雌激活及體外受精后早期胚胎的發(fā)育情況?！窘Y果】在體外成熟液中添加10～20 μmol/L EGCG有利于水牛卵母細胞體外成熟過程中卵丘擴展，卵丘擴展指數(shù)（CEI）分別為2.49%和2.42%，卵母細胞成熟率（59.31%和50.98%）顯著高于未添加EGCG的CK組（P<0.05，下同），MII期卵母細胞的GSH含量（3.21和3.25 pmol/枚）也顯著高于CK組；添加20～30 μmol/L EGCG可顯著降低水牛MII期卵母細胞的ROS水平。以體外成熟培養(yǎng)獲得的水牛MII期卵母細胞分別進行孤雌激活及體外受精，結果發(fā)現(xiàn)以在體外成熟液中添加10 μmol/L EGCG的效果最佳，其對應的卵裂率和囊胚發(fā)育率均顯著高于CK組?！窘Y論】EGCG可用于優(yōu)化水牛卵母細胞體外成熟體系，能有效提高卵母細胞的成熟率和體外發(fā)育潛力，且以水牛體外成熟液中添加10 μmol/L EGCG的效果最佳。

關鍵詞： 水牛；表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）；卵母細胞；體外成熟；胚胎發(fā)育

中圖分類號： S823.83 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）03-0478-05

0 引言

【研究意義】目前，雖然卵母細胞體外成熟技術在科學研究、醫(yī)學生殖方面取得了長足進展，但囊胚率較低、囊胚質量差、卵子得不到有效利用的問題依然存在，其原因可能是卵母細胞在體外氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡，體外操作與環(huán)境因素致使卵母細胞不可避免地接觸到更多的氧自由基，且得不到母體抗氧化劑的保護（彭中友等，2015）。因此，在卵母細胞體外成熟液中通常會添加外源抗氧化劑，以期有效解決上述問題。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epi-gallocatechin-3-gallate，EGCG）提取自綠茶，其結構中含有多個酚羥基，是高效的植物源性抗氧化劑。已有研究證實，EGCG可提高機體抗氧化能力，顯著降低機體過氧化物的生成（Devika and Stanely，2008），且能有效抑制Fe2+和H2O2誘發(fā)的脂質過氧化反應（李太坤，2012）。若將EGCG應用到卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系中，勢必能促進胚胎工程的快速發(fā)展?！厩叭搜芯窟M展】至今，有關家畜卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系中添加外源抗氧化劑的研究已有較多報道。Bormann等（2003）研究發(fā)現(xiàn)，在成熟液中添加適量的維生素能提高山羊卵母細胞達MII期的比率及胚胎發(fā)育率。Tao等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，維生素C和E對豬卵母細胞體外成熟有促進作用，可提高其體外成熟率。Gasparrini等（2006）報道，將半胱胺和胱氨酸添加至體外成熟液中，有利于卵母細胞減數(shù)分裂，提高其成熟率。Wang等（2007）研究表明，添加10和15 μmol/L綠茶多酚可促進牛卵母細胞第一極體排出，獲得更高的體外發(fā)育率。彭中友等（2015）研究表明，豬卵母細胞體外成熟液中添加生長分化因子9（GDF9）一定程度上能提高卵母細胞及胚胎的發(fā)育能力，同時添加GDF9和抗卵泡抑素（FST）抗體對胚胎發(fā)育的促進作用具有加性效應。有關EGCG在哺乳動物體外受精研究方面的應用也有報道，Roth等（2008）研究表明，EGCG可增強胚胎抵抗母體熱應激的能力，促進小鼠胚胎發(fā)育；Spinaci等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，在豬體外受精過程中，EGCG可減少H2O2產生，且以添加10 μg/mL的效果最佳；尚利青等（2009）研究表明，EGCG能促進山羊卵母細胞體外成熟；李擁軍等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠HTF和TCM-199兩種體系中添加20 μmol/L的EGCG能提高卵母細胞體外成熟率、精子受精率和胚胎發(fā)育率。【本研究切入點】EGCG具有很強的抗氧化性，能清除健康細胞中的活性氧（ROS），保護細胞和DNA免受損害，且能作用于與自由基有關的酶類，從而改善細胞質量及提高體外發(fā)育能力，但將EGCG用于水牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的研究尚無報道?！緮M解決的關鍵問題】在水牛卵母細胞體外成熟液中添加不同濃度的EGCG，探討EGCG對提高卵母細胞成熟質量與早期胚胎發(fā)育能力的影響，以期進一步優(yōu)化水牛體外胚胎生產體系及提高其體外胚胎生產效率。

1 材料與方法

1. 1 卵母細胞體外成熟

水牛卵巢收集于南寧某屠宰場，卵母細胞的采集和體外成熟參照蔣麗等（2013）的方法。EGCG購自成都普瑞發(fā)科技開發(fā)有限公司，純度99.4%。水牛卵母細胞體外成熟液添加EGCG的濃度分別為0（CK）、5、10、20和30 μmol/L。

1. 2 卵丘擴展評定及卵母細胞成熟判定

卵丘擴展評定及卵丘擴展指數(shù)（Cumulus expansion index，CEI）計算參照Fagbohun和Downs（1990）的方法。卵母細胞成熟的判定標準為第一極體是否排出。水牛卵母細胞體外成熟22～24 h，去除卵丘細胞后，即可在體視顯微鏡下觀察第一極體的排出情況。

1. 3 卵母細胞內活性氧（ROS）水平測定

選用索來寶（CA1410）活性氧檢測試劑盒進行ROS水平測定。其原理為活性氧可將無熒光的二氯二氫熒光素—乙酰乙酸酯（DCFH-DA）氧化成可發(fā)出熒光的二氯熒光黃（DCF），通過激光共聚焦顯微鏡拍照，然后根據(jù)DCF熒光強度記錄細胞內ROS水平。

1. 4 卵母細胞內谷胱甘肽（GSH）含量測定

選用總谷胱甘肽檢測試劑盒進行GSH含量測定。單個卵母細胞GSH含量（pmol/枚）=樣本總含量/測定卵母細胞總數(shù)。

1. 5 孤雌激活與體外受精

孤雌激活采用化學激活法，將體外培養(yǎng)獲得的水牛MII期卵母細胞置于添加5 μmol/L離子酶素的洗卵液中激活5 min，再轉移至2 mmol/L的6-DMAP培養(yǎng)液中培養(yǎng)6 h，經培養(yǎng)液洗2～3次后置于單層顆粒中共培養(yǎng)。體外受精參照蔣麗等（2013）的方法。孤雌激活和體外受精胚胎均隔天更換一半培養(yǎng)液，第3 d統(tǒng)計卵裂率，第6～8 d統(tǒng)計囊胚發(fā)育率。

1. 6 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)均采用PASW Statistics 17.0軟件進行單因素ANOVA分析。

2 結果與分析

2. 1 成熟液中添加EGCG對水牛卵母細胞卵丘擴展的影響

如表1所示，10和20 μmol/L處理組水牛卵母細胞的CEI分別為2.49%和2.42%，均顯著高于CK組（P<

0.05，下同），而5和30 μmol/L處理組的CEI與CK組間無顯著差異（P>0.05，下同）。說明成熟液中添加10～20 μmol/L EGCG有利于水牛卵母細胞體外成熟過程中卵丘的擴展。

2. 2 成熟液中添加EGCG對水牛卵母細胞體外成熟率的影響

第一極體排出是卵母細胞從GV期發(fā)育到MII期的標志，也是評定卵母細胞成熟的標準。如表2所示，10和20 μmol/L處理組的水牛卵母細胞成熟率（59.31%和50.98%）顯著高于CK組（45.26%），且二者間差異顯著；5和30 μmol/L處理組的水牛卵母細胞成熟率（47.04%和42.81%）與CK組的差異不顯著。說明成熟液中添加10～20 μmol/L EGCG能有效促進水牛卵母細胞第一極體的排出。

2. 3 成熟液中添加EGCG對水牛MII期卵母細胞ROS水平的影響

由表3可以看出，20和30 μmol/L EGCG處理組水牛MII期卵母細胞ROS的DCF熒光強度分別為18.77和25.39，與CK組（38.04）間存在顯著差異；雖然10 μmol/L EGCG處理組水牛MII期卵母細胞ROS的DCF熒光強度（28.90）也呈下降趨勢，但與CK組的差異不顯著；5 μmol/L EGCG處理組與CK組的DCF熒光強度基本一致。說明在成熟液中添加20～30 μmol/L EGCG可顯著降低水牛MII期卵母細胞的ROS水平。

2.4 成熟液中添加EGCG對水牛MII期卵母細胞GSH含量的影響

由表4可以看出，在成熟液中添加EGCG后，各處理組水牛MII期卵母細胞的GSH含量均高于CK組，其中5、10和20 μmol/L處理組（3.03、3.21和3.25 pmol/枚）顯著高于CK組，但這3個處理組間差異不顯著。說明在成熟液中添加EGCG不僅能促進水牛卵母細胞成熟，還能提高卵母細胞的GSH合成能力。

2. 5 成熟液中添加EGCG對水牛卵母細胞孤雌激活后發(fā)育潛力的影響

由表5可以看出，在成熟液中添加EGCG后，各處理組水牛MII期卵母細胞經孤雌激活處理，其卵裂率和囊胚發(fā)育率均高于CK組。其中，10 μmol/L處理組孤雌卵的卵裂率（67.07%）和囊胚發(fā)育率為（31.69%）均顯著高于CK組。說明在成熟液中添加EGCG可促進水牛卵母細胞的核成熟，進而提高其早期胚胎發(fā)育能力。

2.6 成熟液中添加EGCG對水牛卵母細胞體外受精后發(fā)育潛力的影響

由表6可以看出，各EGCG添加處理組水牛MII期卵母細胞經體外受精處理后，其卵裂率和囊胚發(fā)育率均高于CK組。其中，10和20 μmol/L處理組的受精卵卵裂率分別為59.64%和53.78%，顯著高于CK組（44.65%）；10 μmol/L處理組的囊胚發(fā)育率為24.68%，顯著高于CK組（15.02%）。說明在成熟液中添加EGCG不僅能促進水牛卵母細胞成熟，還能提高卵母細胞的成熟質量及其受精能力。

3 討論

卵丘細胞在卵母細胞的核成熟和胞質成熟中扮演重要角色（Tanghe et al.，2003）。Mattioli等（1988）報道，豬卵母細胞成熟后擴散的卵丘細胞能誘發(fā)精子發(fā)生頂體反應，從而有利于精子進入卵母細胞。Fukui（1990）、Kikuchi等（1993）也研究發(fā)現(xiàn)，精子進入卵子后雄原核的形成很大程度上取決于卵母細胞的成熟與受精過程中卵丘細胞的作用。可見，卵丘擴展對卵母細胞發(fā)育能力起著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在成熟液中添加一定濃度的EGCG能促進水牛卵母細胞卵丘擴展，提高水牛卵母細胞體外發(fā)育能力，與Mattioli等（1988）報道的研究結果一致。但Ralph等（1995）研究表明，牛卵母細胞的卵丘擴展并不依賴卵母細胞；Vergara等（1997）研究發(fā)現(xiàn)，分別以去除卵丘細胞與保留卵丘細胞的小鼠卵母細胞進行體外受精時無顯著差異。這可能與當?shù)丨h(huán)境氣候、試驗方法、動物體系等因素有關，因此卵母細胞與卵丘擴展的關系有待進一步研究。

EGCG是綠茶中主要且含量豐富的黃酮類物質，是一種天然無毒的強抗氧化劑（Fiorini et al.，2005；谷亞輕，2008），能與其他抗氧化劑相互作用而有效清除有害自由基（Leone et al.，2003；Singh et al.，2011；Jin et al.，2015）。本研究結果表明，在體外成熟液中添加20～30 μmol/L EGCG能顯著降低水牛MII期卵母細胞的ROS水平，與Leone等（2003）的研究結果一致。添加30 μmol/L EGCG能顯著減少水牛MII期卵母細胞的ROS水平，但對水牛卵母細胞成熟及早期發(fā)育效果沒有顯著影響，可能與過度清除ROS有關，卵母細胞的成熟和發(fā)育受氧化因子及相關酶類的同步影響，其主導或拮抗、協(xié)同等作用尚需進一步探究。

GSH是一種三肽硫醇，幾乎存在于所有細胞中，主要功能是參與新陳代謝，可保護細胞抵抗活性氧中間體和自由基的危害。本研究在水牛卵母細胞體外成熟液中添加不同濃度的EGCG，結果發(fā)現(xiàn)MII期卵母細胞的GSH含量均有所增加。其中，5～20 μmol/L EGCG處理組的MII期卵母細胞GSH含量顯著高于CK組，即EGCG促進了水牛卵母細胞體外成熟過程中GSH的合成，而有利于卵母細胞的后期發(fā)育。此外，本研究發(fā)現(xiàn)在體外成熟液中添加10 μmol/L EGCG能顯著促進水牛卵母細胞的成熟和早期胚胎發(fā)育率，添加20 μmol/L EGCG雖然也能顯著促進水牛卵母細胞第一極體排出，但經孤雌激活和體外受精后的早期胚胎發(fā)育潛力不及添加10 μmol/L EGCG的處理組。因此在本研究條件下，以成熟液中添加10 μmol/L EGCG對水牛卵母細胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育的效果最佳。

4 結論

EGCG作為一種植物源的抗氧化劑，可用于優(yōu)化水牛卵母細胞體外成熟體系，能有效提高卵母細胞的成熟率和體外發(fā)育潛力，且以水牛體外成熟液中添加10 μmol/L EGCG的效果最佳。

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（責任編輯 蘭宗寶）