何奇松　陳磊　顏健華　許瑞勝　易春華　韋達有　馮淑萍　黃勝斌　梁晟　熊毅

摘要：【目的】通過原核表達并純化獲得O型口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因及其多表位基因的重組蛋白，為建立O型FMDV抗體ELISA檢測試劑盒及制備動物高免血清提供技術支持?！痉椒ā恳設型FMDV VP1全基因重組質(zhì)粒pMD18-T-T-VP1及串聯(lián)的VP1多表位基因重組質(zhì)粒pMD18-T-O-VP1為模板，通過特異性引物擴增并回收目的基因，構建重組質(zhì)粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1，然后轉入大腸桿菌BL211（DE3）中誘導表達，并以SDS-PAGE和Western blotting對融合蛋白進行分析鑒定?！窘Y果】O型FMDV的VP1基因及其多表位基因在大腸桿菌BL21（DE3）中得到正確表達，表達的兩種融合蛋白主要以包涵體形式存在，純度較高，且均能與豬抗O型FMDV陽性血清發(fā)生特異性結合，具有良好的反應原性?！窘Y論】表達獲得的融合蛋白具有良好的反應原性，可作為包被抗原應用于O型FMDV抗體檢測試劑盒研發(fā)。

關鍵詞： O型FMDV；VP1基因；多表位基因；原核表達；純化；鑒定

中圖分類號： S852.659.6 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）03-0472-06

0 引言

【研究意義】口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）已被列為A類動物傳染病，是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）引起的一種高度接觸性傳染?。⊿obrino et al.，2001；顏健華等，2015）。FMDV可感染多種偶蹄動物，傳播迅速，感染率高，一旦暴發(fā)將造成重大的經(jīng)濟損失，許多國家高度重視對該病的研究。自2010年起，我國及周邊國家相繼發(fā)生O型FMD疫情（何繼軍等，2015），且與A型、Asia1型呈交替流行趨勢，涉及面廣、破壞性強（劉暢等，2013）。因此，加強FMD疫情監(jiān)測及預警預報，對有效防控FMD及促進我國畜牧業(yè)健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】組成FMDV衣殼的主要結構蛋白有4種，分別為VP1、VP2、VP3和VP4（Collen et al.，1991）。FMDV的抗原區(qū)域主要位于結構蛋白VP1的第141～160位和第200～213位氨基酸殘基，可誘導動物機體產(chǎn)生中和抗體，同時也是抗原性的高變區(qū)（Mateu et al.，1996；柳紀省，1999）。因此，研究分析FMDV主要抗原區(qū)域的高變區(qū)不僅對揭示病毒遺傳變異機理具有重要意義，還能為FMD流行病學研究及新型疫苗研制提供參考依據(jù)。目前，我國已有研究以VP1蛋白的第21～40位及第141～160位基因片段與β-半乳糖甘基因構建重組表達載體（楊志軍等，2000），或?qū)⒇i重鏈恒定區(qū)作為抗原載體的DNA疫苗（李金光等，2001），經(jīng)相關動物試驗證實免疫效果良好。梁特等（2013）、解銀麗等（2015）采用桿狀病毒表達系統(tǒng)成功構建并表達了O型FMDV衣殼蛋白的重組桿狀病毒，為O型FMDV疫苗的研究奠定了基礎。特尼格爾等（2015）研制的多型FMDV VP1表位融合蛋白與O型、A型和Asia1型FMDV陽性血清均能特異性結合，為VP1表位肽的免疫原性研究提供了參考?！颈狙芯壳腥朦c】鑒于O型FMDV近年來的流行趨勢及FMDV抗原結構的復雜性，且不同血清型、基因型和分離株間的抗原位點及抗原表位均存在差別，因此有必要針對O型FMDV的VP1基因及其主要的抗原表位進行深入研究，為今后有效防控O型FMD提供參考?！緮M解決的關鍵問題】采用原核表達系統(tǒng)對O型FMDV VP1基因及串聯(lián)的VP1多表位基因進行表達，對表達所得的兩種目的蛋白進行鑒定，分析其特異性及反應原性，以期為建立針對O型FMDV的競爭ELISA檢測方法及制備動物高免血清提供技術支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

O型FMDV VP1全基因重組質(zhì)粒pMD18-T-T-VP1及串聯(lián)的VP1多表位基因重組質(zhì)粒pMD18-T-O-VP1由廣西動物疫病預防控制中心家畜疫病診斷實驗室保存提供；DL2000 DNA Marker、氨芐青霉素（Amp）貯存液、大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞、小量質(zhì)粒提取試劑盒等購自天跟生化科技（北京）有限公司；EcoR I和Xho I限制性內(nèi)切酶、膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶、IPTG等購自寶生物工程（大連）有限公司；豬抗O型FMDV陽性血清購自中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗豚鼠IgG抗體、低分子量蛋白質(zhì)Marker購自北京博奧森生物技術有限公司。

1. 2 引物設計與合成

根據(jù)原核表達載體（pET-32a和pGEX-6p-1）的酶切位點、FMDV VP1基因開放閱讀框及其串聯(lián)后VP1多表位基因，運用Oligo 6.0軟件設計2對表達引物（表1）。每條上游引物的5'端均添加EcoR I酶切位點（下劃線部分），下游引物的5'端均添加Xho I酶切位點（下劃線部分）。引物均由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1. 3 原核重組表達載體構建

以重組質(zhì)粒pMD18-T-T-VP1和pMD18-T-O-VP1為模板，用特異性引物VP1/VP2、O1/O2擴增并回收目的基因。采用EcoR I和Xho I進行雙酶切，并用同樣的酶切處理原核表達載體pET-32a和pGEX-6p-1，分別將擴增獲得的目的基因酶切回收產(chǎn)物與表達載體的酶切回收產(chǎn)物進行連接，然后轉化BL21（DE3）感受態(tài)細胞，提取重組質(zhì)粒后，對陽性重組質(zhì)粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1進行鑒定。

1. 4 誘導表達重組菌

對陽性重組質(zhì)粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1的菌液進行復蘇，于37 ℃下?lián)u床（180 r/min）過夜培養(yǎng)。將復蘇菌液加入到含Amp的LB培養(yǎng)液中，37 ℃下斜搖（200 r/min）培養(yǎng)，待菌液OD值達0.4～0.6時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進行誘導表達，分別在重組菌誘導前和誘導后1、2、3、4和5 h取樣，離心收集菌體后，通過SDS-PAGE分析重組蛋白的表達情況，再采用掃描的方法分析重組蛋白在菌體中的具體含量。

1. 5 重組表達菌表達形式確定

在最佳誘導表達條件下，取誘導表達后的菌液50 mL，10000×g離心10 min，棄上清液；用PBS洗滌重組菌沉淀，重復洗滌3次；加入30 mL PBS重懸重組菌沉淀，反復凍融3次后，在冰浴中超聲波裂解40 min；離心后分別收集裂解的沉淀和上清液，通過SDS-PAGE分析表達目的蛋白的表達形式。

1. 6 重組蛋白純化

重組蛋白pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1均采用柱層析純化方法進行純化，其純化步驟按照試劑盒說明進行操作，然后采用SDS-PAGE分析兩個重組蛋白的純化效果。

1. 7 Western blotting鑒定

將已純化好的重組蛋白PET-32a-VP1和pGEX- 6P-1-VP1進行SDS-PAGE分析，目的蛋白通過蛋白轉膜儀轉移到硝酸纖維素（NC）膜上，然后參照汪家政和范明（2000）的方法進行Western blotting鑒定。

2 結果與分析

2. 1 原核重組表達載體

采用特異性表達引物VP1/VP2擴增得到完整的VP1基因，大小為639 bp（圖1）；采用特異性表達引物O1/O2擴增得到含VP1主要抗原位點基因片段，大小為384 bp（圖2），兩個目的片段均與預期結果一致。將兩個目的片段分別克隆至原核表達載體pET-32a和pGEX-6p-1，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定，結果顯示重組質(zhì)粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1的目的片段與預期結果一致（圖3和圖4）。

2. 2 重組菌的融合表達及SDS-PAGE分析結果

重組菌pET-32a-VP1/BL21和pGEX-6p-1-VP1/BL21分別于誘導前和誘導后1、2、3、4和5 h取樣， SDS-PAGE分析結果顯示，重組菌pET-32a-VP1/BL21經(jīng)IPTG誘導5 h后其目的蛋白表達量達到峰值，在相對分子量44.0 kD處有一條明顯增量的蛋白條帶（圖5），與預期結果相符；重組菌pGEX-6P-1-VP1/BL21經(jīng)IPTG誘導4 h后其目的蛋白表達量達到峰值，在相對分子量42.0 kD處出現(xiàn)一條明顯增量的蛋白條帶（圖6），與預期結果相符；而未經(jīng)誘導的菌液無任何表達蛋白條帶出現(xiàn)。

2. 3 融合表達產(chǎn)物的可溶性分析結果

以1 mmol/L IPTG誘導3 h的重組菌pET-32a- VP1/BL21和pGEX-6p-1-VP1/BL21經(jīng)超聲波裂解后，收集超聲波裂解菌液離心所得上清液和沉淀進行SDS-PAGE分析，結果顯示，兩種融合蛋白在菌體中主要以包涵體的形式存在（圖7）。

2. 4 融合蛋白的純化結果

蛋白包涵體經(jīng)層析柱純化復性后，得到的融合蛋白進行SDS-PAGE分析鑒定，結果發(fā)現(xiàn)融合蛋白條帶大小與預期結果一致，且條帶較清晰、單一（圖8），說明融合蛋白純化效果較好。

2. 5 融合蛋白的Western blotting鑒定結果

對純化復性的融合蛋白pET-32a-VP1和pGEX- 6p-1-VP1進行Western blotting鑒定，結果顯示在預期目的處出現(xiàn)特異性反應條帶（圖9和圖10），說明誘導表達獲得的融合蛋白均能與豬抗O型FMDV陽性血清發(fā)生特異性結合，即具有免疫學活性。

3 討論

FMDV的VP1基因由639個核苷酸組成，共編碼213個氨基酸，是病毒結構中最重要的抗原位點及抗原變異的關鍵域區(qū)（Mateu et al.，1996；柳紀省，1999），可誘導動物機體產(chǎn)生中和抗體。VP1蛋白的第21～40位氨基酸肽段是重要的T細胞抗原蛋白（Collen et al.， 1991）；第141～160位、第200～213位氨基酸肽段能夠保護動物抵抗病毒攻擊，是重要的B細胞抗原表位（Bittle et al.，1983）；第40～60位氨基酸肽段具有調(diào)節(jié)第141～160位、第200～213位氨基酸抗原表位的功能，也是重要的B細胞抗原表位（Parry et al.，1990）。本研究選用的VP1多表位基因是由第21～60位、第141～160位及第200～213位氨基酸肽段串聯(lián)構成，既含T細胞表位，又含B細胞表位。邵軍軍和?；菔|（2008）研究發(fā)現(xiàn)，可通過增加抗原表位、引入外源載體蛋白或T細胞表位等方法提高表位肽的免疫原性；在特異性免疫應答中，T細胞表位發(fā)揮重要作用，且部分B細胞表位也需要與T細胞表位相互作用才能誘導動物機體內(nèi)產(chǎn)生抗體。因此，本研究選擇VP1全長基因及VP1多表位基因作為表達的目的基因，以期鑒定兩種目的基因表達所得融合蛋白的反應原性及特異性，并比較兩者間的差異，為下一步建立ELISA選擇合適的包被抗原及研制FMDV重組蛋白亞單位疫苗提供參考。

本研究誘導表達獲得的融合蛋白主要以包涵體形式存在。包涵體是由于融合蛋白在其自身的表達過程中對環(huán)境不適應，導致不能形成正確的次級鍵或缺乏依稀蛋白質(zhì)折疊的輔助因子等原因所形成（夏啟玉等，2007）。以包涵體形式存在的重組蛋白具有以下優(yōu)點（羅莉等，2012）：（1）雜蛋白在包涵體中的含量較低，采用離心方法即可達到與可溶性蛋白分離的目的，便于分離純化；（2）可避免菌體蛋白酶對外源蛋白的降解；（3）降低了胞內(nèi)外源蛋白濃度，利于目的蛋白表達量的提高；（4）包涵體對機械攪拌和超聲波破碎均不敏感，易與細胞膜碎片進行分離。但以包涵體形式存在的重組蛋白是需要經(jīng)過變性劑溶解，再進行復性才能得到溶解的蛋白質(zhì)。

本研究選取pET-32a和pGEX-6P-1為原核表達載體，其目的是為了避免載體自身表達蛋白與抗原蛋白產(chǎn)生非特異性結合，而產(chǎn)生假陽性對研究結果造成影響。大腸桿菌BL21（DE3）菌株是以T7 RNA聚合酶為表達系統(tǒng)的高效外源基因蛋白表達宿主，尤其適合于非毒性蛋白的表達。本研究選取大腸桿菌BL21（DE3）作為宿主菌表達FMDV的主要結構蛋白VP1及其主要抗原位點的基因蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分析和Werstern blotting鑒定，結果顯示，融合蛋白均得到正確表達。此外，選用大腸桿菌表達VP1多表位基因的蛋白作為包被抗原，可去除無關基因的干擾，提高包被抗原性，防止假陽性產(chǎn)生。

4 結論

本研究表達獲得的融合蛋白具有良好的反應原性，可作為包被抗原應用于O型FMDV抗體檢測試劑盒研發(fā)。

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（責任編輯 蘭宗寶）