張彬　何蘋萍　黃婷　陳福艷　謝達(dá)祥　陳曉漢

摘要：【目的】對(duì)伴有空腸空胃癥狀的發(fā)病凡納濱對(duì)蝦苗進(jìn)行病原分離鑒定及藥敏試驗(yàn)，為有效防治對(duì)蝦早期死亡綜合癥（EMS）及開展相關(guān)領(lǐng)域研究提供基礎(chǔ)資料?！痉椒ā恳猿Ｒ?guī)方法進(jìn)行患病蝦苗病原菌分離，通過(guò)透射電鏡觀察、Vitek 2 GN全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)及16S rRNA序列擴(kuò)增等進(jìn)行病原菌鑒定，并以K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。【結(jié)果】從患病蝦苗中分離獲得2株優(yōu)勢(shì)菌株（HTW140601和HTW140602），根據(jù)分離菌株的菌體形態(tài)、生理生化特性及16S rDNA序列分析結(jié)果，分別判定為鮑希瓦氏菌（Shewanella haliotis）和創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）。菌株HTW140601和HTW140602對(duì)頭孢曲松、慶大霉素、氧氟沙星均表現(xiàn)出高度敏感?！窘Y(jié)論】創(chuàng)傷弧菌是引起凡納濱對(duì)蝦苗空腸空胃的致病菌，實(shí)際生產(chǎn)中可選用頭孢曲松、慶大霉素、氧氟沙星進(jìn)行防治。

關(guān)鍵詞： 凡納濱對(duì)蝦；蝦苗；創(chuàng)傷弧菌；鮑希瓦氏菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)

中圖分類號(hào)： S945.46 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）03-0506-05

0 引言

【研究意義】凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）是迄今世界上養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的優(yōu)良蝦種，但隨著對(duì)蝦集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，各種疾病頻繁發(fā)生已成為影響對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的主要因素。高健康蝦苗是對(duì)蝦養(yǎng)殖成功的重要保障之一，因此，研究引發(fā)蝦苗病害的病原及其防治措施，對(duì)促進(jìn)我國(guó)對(duì)蝦集約化養(yǎng)殖的健康發(fā)展具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】近年來(lái)，對(duì)蝦早期死亡綜合癥（Early mortality syndrome，EMS）在全球各地肆行。該病在我國(guó)已成為對(duì)蝦養(yǎng)殖早期高死亡率、高排塘的主要原因，致使對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)承受重大損失（周勝錳，2013）。凡納濱對(duì)蝦EMS又稱為急性肝胰腺壞死癥（Acute hepatopancreatic necrosis syndrome，AHPNS），多發(fā)生在養(yǎng)殖期30 d內(nèi)，病蝦體色白濁并微紅，肝胰腺腫大、呈淡白或淡黃色，最后萎縮。發(fā)病對(duì)蝦在水面游動(dòng)或趴伏在塘邊，胃空腸空，病情發(fā)展迅速，在我國(guó)通常被稱為偷死病（文國(guó)樑等，2015）。目前，美國(guó)、泰國(guó)、印度等國(guó)家將凡納濱對(duì)蝦EMS病原認(rèn)定為副溶血弧菌或變種的副溶血弧菌（Joshi et al.，2014；Kumar et al.，2014；Jee et al.，2015），而國(guó)內(nèi)對(duì)于該病病原的研究尚無(wú)定論，仍處于初步研究階段。劉群等（2014）從疑似患EMS的對(duì)蝦中檢測(cè)出黃頭病毒（Yellow-head virus，YHV）的一種新株型。黃志堅(jiān)等（2016）研究表明，對(duì)蝦EMS不是由單一病毒所引起，而且與水體理化因子（氨氮、亞硝酸鹽等）密切相關(guān)，尤其在氨氮和亞硝酸鹽濃度較高的養(yǎng)殖池塘容易暴發(fā)EMS?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】空腸空胃是對(duì)蝦EMS的主要癥狀，因此對(duì)引起蝦苗空腸空胃的病原菌進(jìn)行鑒別研究是確保高健康蝦苗生產(chǎn)的前提，但目前國(guó)內(nèi)鮮見相關(guān)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】對(duì)伴有空腸空胃癥狀的發(fā)病凡納濱對(duì)蝦苗進(jìn)行病原分離鑒定及藥敏試驗(yàn)，旨在為有效防治對(duì)蝦EMS及開展相關(guān)領(lǐng)域研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

患病凡納濱對(duì)蝦苗來(lái)自廣西某蝦苗場(chǎng)；TCBS、TSA、TSB培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；細(xì)菌藥物敏感紙片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；2×Tap PCR Master Mix、細(xì)菌DNA提取試劑盒、離心柱型普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；擴(kuò)增引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，其中16S rRNA引物序列為16S rRNA1（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和16S rRNA2（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。

1. 2 病癥觀察

與正常蝦苗個(gè)體相比，觀察患病蝦苗的發(fā)病癥狀，包括肝胰腺、腸道及內(nèi)容物、腹節(jié)肌肉等。

1. 3 病原菌分離

用無(wú)菌紗布收集蝦苗，滅菌生理鹽水清洗數(shù)次，轉(zhuǎn)入無(wú)菌EP管中勻漿，6000 r/min離心后取上清液，以生理鹽水進(jìn)行10～1000倍梯度稀釋，將不同稀釋倍數(shù)的上清液涂布于TCBS培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)16～24 h后取出觀察菌落生長(zhǎng)情況。將培養(yǎng)獲得的菌落進(jìn)行純化，挑取單個(gè)菌落接種至TSB培養(yǎng)基，部分菌液4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 分離菌株培養(yǎng)特性及其形態(tài)電鏡觀察

28 ℃培養(yǎng)24 h后取出TCBS培養(yǎng)基進(jìn)行肉眼觀察，同時(shí)用pH 7.2磷鎢酸進(jìn)行負(fù)染色，制備超薄切片，于透射電鏡下觀察并拍照。

1. 5 生化特性鑒定

通過(guò)Vitek 2 GN全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生化特性鑒定。

1. 6 16S rDNA序列測(cè)定分析

用細(xì)菌DNA提取試劑盒對(duì)菌液中的DNA進(jìn)行提取，以16S rRNA為靶序列的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，在紫外透射儀下將含目的條帶的瓊脂糖凝膠切下，利用離心柱型普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序得到的序列與NCBI網(wǎng)站GenBank中的核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行BLAST分析，選取同源性最高的序列及幾種模式弧菌16S rRNA，采用DNASTAR軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 7 藥敏試驗(yàn)

以K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行病原菌的藥敏試驗(yàn)。取過(guò)夜培養(yǎng)的菌液200 μL均勻涂布于TSA培養(yǎng)基上，待菌液吸附5 min后用無(wú)菌鑷子將各種抗菌藥物圓形紙片分別貼于培養(yǎng)基表面，30 ℃培養(yǎng)20 h后觀察結(jié)果。根據(jù)藥物紙片周圍有無(wú)抑菌圈及抑菌圈直徑判斷該菌對(duì)各種藥物的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 患病蝦苗癥狀

患病苗池中的凡納濱對(duì)蝦苗出現(xiàn)浮頭、游池現(xiàn)象，患病蝦苗臨床癥狀均表現(xiàn)為肝胰腺顏色變淡，部分出現(xiàn)萎縮，空腸空胃，有些腹節(jié)肌肉略微白濁（圖1）。

2. 2 分離菌培養(yǎng)特性及菌體形態(tài)

從患病蝦苗中分離獲得2株優(yōu)勢(shì)菌株，分別命名為HTW140601和HTW140602。菌株HTW140601在TCBS培養(yǎng)基上，其菌落呈綠色（圖2-a）；負(fù)染電鏡下菌株HTW140601呈桿狀（圖3-a），極生單鞭毛。菌株HTW140602在TCBS培養(yǎng)基上呈黃色（圖2-b），革蘭氏染色呈陰性；負(fù)染電鏡下菌株HTW140602呈短桿狀（圖3-b），兩端鈍圓，極生單鞭毛。

2. 3 分離菌生理生化鑒定結(jié)果

由表1可知，菌株HTW140601對(duì)谷氨酰芳胺酶、鳥氨酸脫羧酶和磷酸酶呈陽(yáng)性反應(yīng)，對(duì)D-葡萄糖、蔗糖發(fā)酵等呈陰性反應(yīng)；菌株HTW140602對(duì)D-葡萄糖、蔗糖發(fā)酵等呈陽(yáng)性反應(yīng)，對(duì)谷氨酰芳胺酶、鳥氨酸脫羧酶等呈陰性反應(yīng)。

2. 4 16S rDNA序列比對(duì)分析結(jié)果

對(duì)菌株HTW140601和HTW140602進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，其16S rDNA序列分別為1468和1480 bp。采用GenBank進(jìn)行BLAST相似性搜索比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株HTW140601與鮑希瓦氏菌（SS263-N4）的相似度最高，而菌株HTW140602與創(chuàng)傷弧菌（JQ307112.1）的相似度最高，其對(duì)應(yīng)的同源性分別為99.0%和98.0%。運(yùn)用DNASTAR構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖5），并結(jié)合生化鑒定結(jié)果可認(rèn)定分離獲得的2株優(yōu)勢(shì)菌株（HTW140601和HTW140602）分別為鮑希瓦氏菌（Shewanella haliotis）和創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）。

2. 5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，在18種藥物中，菌株HTW140601對(duì)卡那霉素、阿莫西林、利福平、恩諾沙星、頭孢曲松、頭孢哌酮、慶大霉素、氧氟沙星、諾氟沙星、頭孢克洛、頭孢唑啉等11種藥物表現(xiàn)高度敏感，對(duì)頭孢克肟、林可霉素、復(fù)方新諾明、羅紅霉素4種藥物呈耐藥性；菌株HTW140602對(duì)羅紅霉素、頭孢曲松、慶大霉素、氧氟沙星4種藥物表現(xiàn)高度敏感，而對(duì)頭孢克肟、林可霉素、阿莫西林、復(fù)方新諾明、羧芐青霉素、氨曲南、利福平、頭孢哌酮、諾氟沙星、頭孢唑啉10種藥物呈耐藥性。

3 討論

目前，關(guān)于對(duì)蝦空腸空胃病原的研究尚無(wú)定論。國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了多種病原篩查，發(fā)現(xiàn)雖然能從患病對(duì)蝦中分離獲得有致病力的副溶血弧菌等細(xì)菌性病原（張寶存等，2012），但病理學(xué)和人工感染試驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)菌感染屬于繼發(fā)感染（Flegel，2012；Lightner et al.，2012）。此外，由于放苗密度過(guò)高、養(yǎng)殖水質(zhì)變差、弧菌大量繁殖、蝦苗腸道菌群比例失調(diào)、肝胰腺消化功能紊亂、蝦苗不攝食或攝食過(guò)少，也可能造成對(duì)蝦蝦苗空腸空胃。本研究結(jié)果表明，從患病蝦苗體內(nèi)分離獲得的優(yōu)勢(shì)菌為鮑希瓦氏菌和創(chuàng)傷弧菌，其中，創(chuàng)傷弧菌（菌株HTW140602）是導(dǎo)致蝦苗空腸空胃的病原，但其致病性有待進(jìn)一步驗(yàn)證；而鮑希瓦氏菌（菌株HTW140601）可能是作為腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群存在，其依據(jù)是國(guó)內(nèi)外至今尚無(wú)鮑希瓦氏菌感染凡納濱對(duì)蝦的相關(guān)報(bào)道，但有利用該菌作為對(duì)蝦腸道益生菌抑制病原弧菌增殖的研究報(bào)道（Hao et al.，2014）。

本課題組曾對(duì)凡納濱對(duì)蝦苗種繁育各環(huán)節(jié)水體中弧菌數(shù)量和優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在各繁育環(huán)節(jié)水體中均以溶藻弧菌為優(yōu)勢(shì)菌群，而本研究從患病蝦苗體內(nèi)分離獲得的優(yōu)勢(shì)弧菌為創(chuàng)傷弧菌，說(shuō)明水體中的優(yōu)勢(shì)弧菌未必是致病菌。創(chuàng)傷弧菌廣泛存在于近海及河口環(huán)境中，從牡蠣、蛤、螃蟹、扇貝、蝦、魚等水產(chǎn)動(dòng)物及浮游生物沉積物中均可分離獲得此菌，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中危害較大的一種細(xì)菌性病原（Biosca et al.，1991；Vinh et al.，2006；Sharshar and Azab，2008；黎炯等，2011）。因此，生產(chǎn)上定期監(jiān)測(cè)養(yǎng)蝦池中弧菌的數(shù)量變化對(duì)預(yù)防蝦病發(fā)生具有重要意義，尤其是苗種繁育后期和放苗前。蝦苗培育過(guò)程是個(gè)多因素的復(fù)雜系統(tǒng)，要取得對(duì)蝦苗種繁育的成功，不僅要控制弧菌數(shù)量，還必須控制好放苗密度、餌料投喂量、有毒藻類的繁殖，保持良好的水質(zhì)，預(yù)防病原繁殖擴(kuò)散。

抗生素濫用致使細(xì)菌產(chǎn)生了越來(lái)越廣泛的耐藥性，現(xiàn)已危害到水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)的生物安全（張寶存等，2012）。本研究的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，鮑希瓦氏菌（菌株HTW140601）對(duì)卡那霉素、阿莫西林、利福平、恩諾沙星、頭孢曲松、頭孢哌酮、慶大霉素、氧氟沙星、諾氟沙星、頭孢克洛、頭孢唑啉11種藥物表現(xiàn)出高度敏感，創(chuàng)傷弧菌（菌株HTW140602）僅對(duì)羅紅霉素、頭孢曲松、慶大霉素、氧氟沙星4種藥物表現(xiàn)出高度敏感。綜合2株分離菌株的藥敏性，可選用頭孢曲松、慶大霉素、氧氟沙星3種藥物進(jìn)行防治。

4 結(jié)論

創(chuàng)傷弧菌是引起凡納濱對(duì)蝦苗空腸空胃的致病菌，而鮑希瓦氏菌是作為腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群存在，實(shí)際生產(chǎn)中可選用頭孢曲松、慶大霉素、氧氟沙星進(jìn)行防治。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）