吳紹華 郝澤蕓 張世鑫 鄧小敏 田維敏

摘 要 DELLA是赤霉素信號傳導(dǎo)途徑中一類重要的阻遏蛋白。本研究通過RT-PCR技術(shù)，從橡膠樹優(yōu)良品種‘熱研7-33-97膠乳中克隆了1個DELLA蛋白編碼基因（GenBank登錄號為KT696440）。該基因全長cDNA序列2 135 bp，閱讀框1 905 bp，編碼634個氨基酸，其編碼蛋白含有DELLA和GRAS結(jié)構(gòu)域，分子量為69.89 ku，理論等電點為5.50。HbGAIP-B氨基酸序列與麻瘋樹JcGAIP-B、蓖麻RcGAIP-B、擬南芥AtRGA、AtGAI、AtRGL1、AtRGL2和AtRGL3的相似性分別為82.43%、78.18%、65.05%、61.73%、52.28%、53.51%和49.92%。進化樹分析表明，HbGAIP-B與JcGAIP-B親緣關(guān)系最近。定量PCR分析表明，HbGAIP-B的表達受割膠處理誘導(dǎo)下調(diào)。赤霉素和乙烯利處理4 h顯著上調(diào)HbGAIP-B的表達，茉莉酸甲酯處理4 h小幅下調(diào)HbGAIP-B表達。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹；HbGAIP-B；基因克隆；基因表達分析

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

Abstract DELLA are kind of repressor proteins of GA signaling. In this work，a full length cDNA sequence of HbGAIP-B（GenBank accession no. KT696440）was obtained from the latex of rubber tree clone‘CATAS7-33-97by RT-PCR. HbGAIP-B was 2 135 base pairs（bp）in length and contained an open reading frame（ORF）of 1 642 bp. The ORF encoded 613 amino acid residues， which contained DELLA and GRAS domain， with a predicted molecular mass of 66.476 ku and a pI of 5.19. The deduced amino acid sequences of HbGAIP-B showed high identities of 82.43%， 78.18%， 65.05%， 61.73%， 52.28%， 53.51% and 49.92% to JcGAIP-B， RcGAIP-B， AtRGA， AtGAI， AtRGL1， AtRGL2 and AtRGL3， respectively. Real-time quantitative PCR analysis in the latex showed that， compared with the control， HbGAIP-B transcript levels were significantly down-regulated in latex by consecutive tapping. The transcript levels were significantly up-regulated at 4 hours by gibberellins and ethephon. And methyl jasmonate reduced slightly the expression of HbGAIP-B.

Key words Hevea brasiliensis； HbGAIP-B； Gene clone； Gene expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.05.006

赤霉素（Gibberellins 或 Gibberellic acid，GA）是一種四環(huán)雙萜類植物激素，在植物生長發(fā)育、逆境脅迫中起著重要的調(diào)控作用。GID1（GIBBERELLIN

INSENSITIVE DWARF 1）和DELLA蛋白是GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的兩個重要組分。其中GIDl是GA的受體[1-2]，DELLA蛋白是GA 信號通路中關(guān)鍵的負調(diào)節(jié)因子[3-5]。GA通過與GID1、DELLA蛋白相互作用形成GA-GID1-DELLA復(fù)合體，使得DELLA蛋白被26S泛素蛋白酶體降解[6-8]，解除了DELLA蛋白的阻遏作用，從而啟動了下游基因的表達。DELLA蛋白屬于轉(zhuǎn)錄因子GRAS（GAI，RGA，SCR）家族，在C端有保守的GRAS結(jié)構(gòu)域，在N端有特異的DELLA結(jié)構(gòu)域。目前，在擬南芥中鑒定了5個DELLA蛋白：GA INSENSITIVE（GAI）：REPRESSOR OF ga1-3 （RGA）：REPRESSOR OF ga7-i-LIKE protein（RGL）l，RGL2和RGL3，遺傳分析表明，這5個蛋白在調(diào)節(jié)植物發(fā)育中的功能既有冗余性也有各自獨特的作用[3-4，9-11]。而且，DELLA蛋白在赤霉素、茉莉酸和乙烯三種植物激素介導(dǎo)的信號途徑的交互作用中起著重要的作用[12]。

橡膠樹（Hevea brasiliensis Müll. Arg.）是一種多年生木本熱帶經(jīng)濟作物，通過割膠方式獲得的膠乳是提煉天然橡膠的原料，在保障國民和戰(zhàn)略需求中起著重要的作用?，F(xiàn)有的證據(jù)表明，膠乳中的橡膠烴是一種重要的防御應(yīng)答誘導(dǎo)的次生代謝產(chǎn)物[13]，可能主要受乙烯和茉莉酸信號途徑的調(diào)控[13-21]。由于DELLA蛋白在乙烯和茉莉酸信號途徑中的重要調(diào)控作用。為了進一步研究膠乳中DELLA蛋白的作用機制，本研究從乳管細胞中克隆了一個DELLA蛋白基因HbGAIP-B的全長cDNA，并分析了其在割膠、赤霉素、乙烯利（Ethephon，ET）和茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate，MeJA）處理下的基因表達模式，為深入研究HbGAIP-B基因在膠乳中的作用機制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試材料橡膠樹‘熱研7-33-97（CATAS 7-33-97）由“國家農(nóng)作物種質(zhì)資源平臺-國家橡膠樹種質(zhì)資源子平臺”提供。割膠處理時，按照1/2螺旋割線，3 d/刀（S/2 d/3）的割制對樹圍一致的8年生未開割樹進行連續(xù)割膠處理，分別采集前3刀的膠乳于RNA提取液中，每處理5棵樹。植物激素赤霉素（gibberellic acid，GA）、乙烯利（Ethephon，ET）及茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate，MeJA）的處理采用的是1年生的萌條，輕輕刮傷萌條第三伸長單位的節(jié)間樹皮，然后分別用100 μmol/L GA3、0.5% ET和0.07% MeJA涂抹刮傷部位后包裹，100 μmol/L GA3和0.5% ET的對照為滅菌水（ddH2O），0.07% MeJA處理的對照為6%的乙醇，分別于處理后的4 h、8 h、1 d、2 d和3 d用刀片割開樹皮取膠乳，每個時間點處理9根萌條，將混合的膠乳采集于RNA提取液中用于RNA提取。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取與cDNA合成 采用RNAprep Pure Plant Kit（TIANGEN）提取橡膠樹的膠乳RNA，DNaseⅠ柱上消化RNA樣品中殘留的微量DNA。采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit （Thermo Fisher）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2 HbGAIP-B基因的全長cDNA擴增 從巴西橡膠樹膠乳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲得了一段注釋為DELLA蛋白的Unigene序列，序列分析顯示該Unigene具有完整的編碼框。因此，根據(jù)Unigene序列設(shè)計該基因的全長cDNA的擴增引物FL-CDNA-F（5′-CCTTACCCATTCGCAGCAG-3′）和FL-CDNA-R（5′-ACCCATTACCAGCTCAGC-3′）對基因序列進行驗證，擴增體系為Takara PrimeSTAR Max Premix（2×）25 μL，F(xiàn)L-CDNA-F（10 μmol/L）2.5 μL，F(xiàn)L-CDNA-R（10 μmol/L）2.5 μL，cDNA模板1 μL，滅菌水補足50 μL。擴增程序為：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠回收試劑盒（TIANGEN）純化目的條帶，克隆至pEASY-Blunt Simple Cloning Vector（TransGen），委托Invitrogen公司進行測序。

1.2.3 生物信息學分析 采用ORF Finder軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）進行開放閱讀框（ORF）預(yù)測，同時翻譯成蛋白序列。DNAMAN軟件對氨基酸進行同源比對分析。ProtParam軟件（http：//au.expasy.org/tools/protparam.html/）在線分析該蛋白的分子量與等電點。ProtScale軟件（http：//web.expasy.org/protscale/）分析蛋白親水性。TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進行蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域分析。SOPMA在線軟件（http：//nhjy.hzau.edu.cn/kech/swxxx/jakj/dianzi/Bioinf7/Expasy/Expasy8.htm）預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)。從NCBI數(shù)據(jù)庫下載不同植物的DELLA蛋白序列，利用軟件MEGA 4.0采用Neighbor-Joining（NJ）模型，并進行1 000次Bootstrap統(tǒng)計學檢驗構(gòu)建包括HbGAIP-B蛋白序列在內(nèi)的植物DELLA蛋白系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 實時熒光定量PCR分析 以橡膠樹HbActin（GenBank HQ260674.1）基因為內(nèi)參，用real-time RT-PCR分析割膠、GA、ET和MeJA處理對HbGAIP-B基因表達的影響。內(nèi)參基因引物為Actin-F（5′-G

ATTCCGTTGCCCAGAAGTC-3′）和Actin-R（5′-CACC

ACTCAGCACAATGTTACC-3′）；HbGAIP-B定量引物為GAIP-B-F（5′-ACTCGTTCTCAACTCAGGCA-3′）和GAIP-B-R（5′-ACCAGCTCAGCAATTCACAT-3′）。

反應(yīng)體系：cDNA模板1 μL，2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）5 μL和10 μmol/L上下游引物各0.3 μL，ddH2O補足10 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)；循環(huán)完成后進行溶解曲線分析。利用CFX manager 3.0軟件，以HbActin作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCq算法分析基因的相對表達量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用one-way ANOVA（Newman-Keuls Multiple Comparison Test）比較割膠處理3個刀次樣品間基因表達量的差異顯著性（p<0.05）；采用one-way ANOVA（Dunnett's Multiple Comparison Test）比較GA、ET和MeJA處理與對照樣品間相對表達量的差異顯著性，p<0.05和p<0.01分別表示每個時間點處理與對照之間在0.05和0.01水平存在的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbGAIP-B基因全長cDNA的克隆及生物信息學分析

通過全長cDNA序列的擴增測序，獲得HbGAIP-B基因全長cDNA序列2 135 bp，含有1 905 bp閱讀框，編碼634個氨基酸，5′非編碼區(qū)序列（Untranslated region，UTR）長118 bp，3′-UTR長112 bp（圖1）。生物信息學分析結(jié)果顯示，HbGAIP-B蛋白的分子式為C3 073H4 793N857O957S26，分子量為69.89 ku，理論等電點為5.50，不穩(wěn)定系數(shù)為48.08，為不穩(wěn)定類蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于親水性蛋白。結(jié)構(gòu)域分析顯示HbGAIP-B蛋白具有GRAS家族的典型結(jié)構(gòu)域，屬于GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族，N末端同源性不高，但具有GA的信號感知區(qū)的DELLA和TVHYNP酸性結(jié)構(gòu)域，中心區(qū)具有VHVID、核定位區(qū)域NLS，起調(diào)節(jié)作用的LZ（亮氨酸重復(fù)序列）和PolyS/T/V（絲氨酸 蘇氨酸 纈氨酸富集區(qū)）區(qū)域，C末端具有發(fā)揮阻遏作用的阻遏區(qū)域RVER和SAW（圖2）。二級結(jié)構(gòu)分析顯示HbGAIP-B蛋白由44.79% α-螺旋、15.30%延伸鏈、7.26% β-轉(zhuǎn)角和32.65%無規(guī)則卷曲組成。

2.2 HbGAIP-B推導(dǎo)的氨基酸序列比對及進化樹構(gòu)建

將橡膠樹HbGAIP-B氨基酸序列與其它植物DELLA蛋白氨基酸序列進行比對，發(fā)現(xiàn)HbGAIP-B與與麻瘋樹（Jatropha curcas）JcGAIP-B（XP_

012072251.1）、蓖麻（Ricinus communis）RcGAIP-B （XP_002527794.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana） AtRGA（NP_178266.1）、AtGAI（NP_172945.1）、AtRGL1（NP_176809.1）、AtRGL2（AEE73945.1）和AtRGL3（AED92433.1）的相似性分別為82.43%、78.18%、65.05%、61.73%、52.28%、53.51%和49.92%（圖2）。構(gòu)建的進化樹表明，橡膠樹HbGAIP-B氨基酸序列與麻瘋樹JcGAIP-B歸為一類，親緣關(guān)系最近（圖3）。

2.3 HbGAIP-B基因表達分析

采用qRT-PCR技術(shù)，以HbActin基因為內(nèi)參，檢測了連續(xù)割膠（Tapping）、赤霉素（GA）、乙烯利（ET）、茉莉酸甲酯（MeJA）對膠乳中的HbGAIP-B基因表達的影響（圖4）。結(jié)果表明，HbGAIP-B基因的表達受割膠處理誘導(dǎo)下調(diào)，前3刀間的基因表達達顯著水平（圖4-A）。同時，HbGAIP-B基因的表達也受植物激素的調(diào)節(jié)，表現(xiàn)為GA處理4 h極顯著上調(diào)HbGAIP-B基因表達（圖4-B）；ET處理4 h后顯著上調(diào)HbGAIP-B基因的表達量，8 h表達量達到最高（圖4-C）；MeJA處理4 h后顯著下調(diào)HbGAIP-B基因的表達，2 d后極顯著上調(diào)HbGAIP-B基因的表達（圖4-D）。

3 討論

橡膠樹乳管數(shù)量、兩次割膠間的膠乳再生與排膠時間是決定橡膠產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。乙烯利是廣泛使用的橡膠增產(chǎn)刺激劑，其效應(yīng)主要是通過提高橡膠樹乳管細胞的基礎(chǔ)代謝和延長膠乳的排膠時間來實現(xiàn)的[22-24]。在乙烯信號響應(yīng)中，ET通過促進ETHYLENE INSENSITIVE3（EIN3）和EIN3-like（EIL）的積累來促進其下游的級聯(lián)反應(yīng)。DELLA蛋白能與EIN3結(jié)合抑制其功能。施加GA處理，可以引起DELLA蛋白的降解，釋放出EIN3促進乙烯信號的響應(yīng)[12]。據(jù)此推測，施加ET和GA可能具有相似的效應(yīng)，這與本研究中GA處理和ET處理樣品中HbGAIP-B基因的表達均為先升高后降低的模式是吻合的。而且ET處理HbGAIP-B基因表達模式與RhGAI1相似，在玫瑰花研究中發(fā)現(xiàn)，RhEIN3-3能直接結(jié)合RhGAI1基因啟動子進而調(diào)控花瓣發(fā)育[25]。另外，DELLA蛋白RGL3可通過競爭性結(jié)合JAZ蛋白來增強EIN3的活性[26]。

茉莉酸是調(diào)控橡膠生物合成的關(guān)鍵因子，目前已發(fā)表的橡膠樹茉莉酸信號途徑的核心組件包括SCF[27]、COI1[28]、JAZs[15，29]、MYCs[17，30]，這些基因的表達受到傷害、割膠或者MeJA的誘導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥DELLAs可競爭性的阻止阻遏蛋白JAZ與轉(zhuǎn)錄激活因子MYC2的結(jié)合，從而提高MYC2調(diào)控其靶基因的能力[31]。Wild等[32]證實MYC2能直接與RGL3啟動子結(jié)合，而RGL3也能與JAZ蛋白互作，表明RGL3蛋白對于JA介導(dǎo)的響應(yīng)是必不可少的。而且擬南芥DELLA蛋白RGA通過結(jié)合MYC2抑制次生代謝產(chǎn)物倍半萜烯合成酶基因TPS21和TPS11的表達[33]。本研究中HbGAIP-B基因表達受割膠處理誘導(dǎo)下調(diào)，且HbGAIP-B基因的表達也受植物激素的調(diào)節(jié)。結(jié)合割膠、ET、MeJA處理對HbGAIP-B基因表達的影響，推測HbGAIP-B可能通過茉莉酸或乙烯信號途徑參與橡膠樹的膠乳代謝，具體作用機制還有待于深入的研究。

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