郭曉強(qiáng)

基因編輯從傳統(tǒng)的基因打靶，到改進(jìn)的嵌合核酸酶技術(shù)，再到最新的RNA或DNA指導(dǎo)的核酸酶技術(shù)，取得了快速發(fā)展，為生命科學(xué)研究和臨床應(yīng)用提供了簡(jiǎn)捷有效的操作工具。其應(yīng)用潛力巨大，但仍須解決脫靶等相關(guān)技術(shù)問(wèn)題。

DNA是遺傳信息載體，基因是一段具特定生物學(xué)功能的DNA片段，決定生物體生老病死等各種生命過(guò)程?；蚓庉嫞╣ene editing）指根據(jù)科研或臨床實(shí)際需要對(duì)目的基因（亦稱(chēng)靶DNA）進(jìn)行插入、移除或替換等精確遺傳操作，從而達(dá)到預(yù)定目的（引入或修復(fù)突變）之過(guò)程。鑒于基因在正常發(fā)育和疾病發(fā)生中的重要性，這項(xiàng)研究的意義不言而喻。而要完成基因編輯，工具必不可少，多種核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)為各種技術(shù)的發(fā)明提供了可靠保證。在此基礎(chǔ)上基因編輯技術(shù)經(jīng)歷了多階段的發(fā)展過(guò)程并顯示了多方面的應(yīng)用前景。

限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用

故事要從1950年代講起。1952年，意大利裔美國(guó)微生物學(xué)家盧里亞（S.E.Luria，1969年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者）發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌限制一修飾現(xiàn)象。同一種噬菌體對(duì)不同菌株具有不同的感染力，如極易感染大腸桿菌C菌株的入噬菌體對(duì)K菌株感染力僅是對(duì)C菌株的千分之一，因此將大腸桿菌K菌株抵抗入噬菌體感染稱(chēng)為“宿主控制的噬菌體限制”，但對(duì)這種現(xiàn)象的機(jī)制缺乏了解。

1962年，瑞士科學(xué)家阿爾伯（W.Arber）提出解釋細(xì)菌修飾一限制機(jī)制的假說(shuō)。他推測(cè)細(xì)菌內(nèi)存在兩類(lèi)酶，一類(lèi)為核酸內(nèi)切酶，可特異識(shí)別噬菌體DNA并進(jìn)行剪切，從而限制入侵；另一類(lèi)為DNA甲基化酶，對(duì)自身DNA相應(yīng)序列進(jìn)行甲基化修飾，破壞核酸內(nèi)切酶的自我識(shí)別，從而避免“誤傷”。

1968年，阿爾伯和美國(guó)梅塞爾森（M.S.Meselson）同時(shí)從大腸桿菌鑒定出核酸內(nèi)切酶，該酶可識(shí)別特定DNA序列，但是在隨機(jī)位置上剪切DNA，不具特異性，稱(chēng)為Ⅰ型限制性內(nèi)切酶。

1970年，美國(guó)微生物遺傳學(xué)家史密斯（H.O.Smith）和同事又從嗜血流感細(xì)菌（Haemophilusinfluenzae）中分離得到一種核酸內(nèi)切酶，該酶可特異識(shí)別噬菌體雙鏈DNA并發(fā)揮剪切作用，但對(duì)細(xì)菌DNA無(wú)效，符合阿爾伯當(dāng)初的預(yù)測(cè)。史密斯和同事還鑒定出該酶的識(shí)別及剪切序列。該酶被命名為HindⅡ，這是人類(lèi)發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)Ⅱ型限制性內(nèi)切酶。HindⅡ的發(fā)現(xiàn)引起科學(xué)界極大關(guān)注，從而掀起了一場(chǎng)尋找Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的熱潮。另一方面，限制性內(nèi)切酶的巨大應(yīng)用潛力不久就被史密斯同事內(nèi)森斯（D.Nathans）發(fā)現(xiàn)和首先開(kāi)發(fā)。

1970年，內(nèi)森斯利用史密斯贈(zèng)予的限制性內(nèi)切酶HindⅡ?qū)υ澈锊《?0（SV40）環(huán)形DNA進(jìn)行酶切，獲得大小不同的11個(gè)DNA片段（意味著SV40基因組含有10個(gè)HindⅡ的識(shí)別與剪切位點(diǎn)），首次獲得了SF40基因組的限制性內(nèi)切酶圖譜。

1978年，阿爾伯、史密斯和內(nèi)森斯因“限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及分子遺傳學(xué)應(yīng)用”而分享諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用為DNA研究提供了重要工具，它們被稱(chēng)為“DNA操作的手術(shù)刀”。

DNA重組和基因工程

在內(nèi)森斯切開(kāi)SV40 DNA基礎(chǔ)上，美國(guó)斯坦福大學(xué)生物化學(xué)家伯格（P.Berg）又往前邁進(jìn)了一大步。

1972年，伯格在體外用限制性內(nèi)切酶將SV40DNA和噬菌體DNA分別切開(kāi)，嗣后又借助DNA連接酶將它們重新連接為整體，從而首次在體外實(shí)現(xiàn)了兩個(gè)不同來(lái)源DNA的人工重組，伯格因這項(xiàng)成就分享1980年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。不久，科恩（S.N.Cohen）和博耶（H.Boyer）進(jìn)一步把重組DNA轉(zhuǎn)入大腸桿菌，開(kāi)啟了基因工程大門(mén)。重組DNA和基因工程的成功，推動(dòng)了生物技術(shù)領(lǐng)域的快速發(fā)展，更重要的是給科研人員提供了無(wú)限想象空間，即人類(lèi)可以用技術(shù)手段對(duì)DNA進(jìn)行主動(dòng)操作，這奠定了今天基因編輯的思想基礎(chǔ)。

同源重組與基因打靶

最早的基因編輯利用機(jī)體自身的同源重組（homologous recombination）。同源重組是指兩段相似或相同序列的DNA發(fā)生交換的現(xiàn)象，主要用于DNA雙鏈斷裂后修復(fù)，此外還是減數(shù)分裂期新序列產(chǎn)生的基礎(chǔ)。早在1947年，美國(guó)微生物學(xué)家萊德伯格（J.Lederberg。1958年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者）就在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了遺傳重組現(xiàn)象，1970年代在哺乳動(dòng)物中也鑒定成功，但對(duì)于機(jī)體內(nèi)部的同源重組是否可應(yīng)用于人工遺傳操作，人們不得而知。

1980年代初，意大利裔美國(guó)遺傳學(xué)家卡佩基（M.R.Capecchi）堅(jiān)信同源重組可應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)DNA的操作。他首先獲得一種攜帶新霉素抗藥基因缺陷的細(xì)胞系（添加新霉素可造成細(xì)胞死亡），然后通過(guò)顯微注射方式將正常新霉素抗藥基因?qū)爰?xì)胞，結(jié)果細(xì)胞恢復(fù)了抗性。實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，通過(guò)同源重組方式可完成基因替換。與此同時(shí)，另一位美國(guó)科學(xué)家史密西斯（O.Smithies）完成了珠蛋白的同源重組實(shí)驗(yàn)。1987年，多家實(shí)驗(yàn)室在小鼠胚胎干細(xì)胞上利用同源重組實(shí)現(xiàn)基因替換和引入突變，并最終制備成功疾病模型。這種技術(shù)一般稱(chēng)為基因打靶（gene targeting）。隨后經(jīng)過(guò)完善與改進(jìn)，該技術(shù)在生命科學(xué)多個(gè)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用，卡佩基、史密斯以及另外一位科學(xué)家也因此分享2007年度的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

雖然基因打靶技術(shù)取得巨大成功，但是該技術(shù)存在一個(gè)明顯缺陷，就是在正常情況下，哺乳動(dòng)物細(xì)胞和模式動(dòng)物體內(nèi)的同源重組發(fā)生率極低，因此基因打靶技術(shù)成功率不高。后來(lái)發(fā)現(xiàn)，DNA雙鏈斷裂（double-strand break，DSB）可使同源重組效率大大提高，于是研究人員開(kāi)始尋找增加細(xì)胞內(nèi)DSB發(fā)生的策略，他們的眼光重又回到限制性內(nèi)切酶。

大范圍核酸酶

然而，傳統(tǒng)的限制性內(nèi)切酶也存在一個(gè)巨大不足，其大部分識(shí)別位點(diǎn)在4～6個(gè)堿基對(duì)（base pair，bp）。這對(duì)體外短片段DNA的操作問(wèn)題不大，但對(duì)基因組層面的操作則問(wèn)題多多。以剪切6bp的內(nèi)切酶為例，理論上平均4096（4⁶）個(gè)堿基就存在一個(gè)剪切位點(diǎn)。如果將這類(lèi)酶應(yīng)用于人基因組（30億堿基對(duì)）的編輯，理論上一次可產(chǎn)生7.3×10⁵個(gè)以上斷裂點(diǎn)；若要保證切割位點(diǎn)唯一性，則須識(shí)別16個(gè)堿基（4¹⁶≈43億）以上（隨后發(fā)展的多種基因編輯技術(shù)的常見(jiàn)識(shí)別位點(diǎn)在20個(gè)上下），傳統(tǒng)限制性內(nèi)切酶顯然無(wú)法應(yīng)用。幸運(yùn)的是，自然界還存在一類(lèi)特殊的核酸內(nèi)切酶。

大范圍核酸酶（meganuclease）亦稱(chēng)歸巢核酸內(nèi)切酶（homing endonuclease），存在于原核生物和真核生物的線粒體/葉綠體等當(dāng)中，大部分由內(nèi)含子編碼。大范圍核酸酶可特異識(shí)別DNA長(zhǎng)片段，一般在12～40bp之間，在數(shù)量上能滿足需求。1985年，一種大范圍核酸酶I-SceI被發(fā)現(xiàn)，它可特異性識(shí)別18 bp的DNA片段，在此基礎(chǔ)上將DNA切開(kāi)而產(chǎn)生雙鏈斷裂。1990年代，I-SceI被用于輔助基因編輯，可使傳統(tǒng)基因打靶效率大大提高。

但大范圍核酸酶在基因編輯的應(yīng)用方面有重大瓶頸。首先，天然大范圍核酸酶種類(lèi)有限，對(duì)于人類(lèi)大部分基因找不到相應(yīng)的酶識(shí)別；而新找一個(gè)識(shí)別給定序列的大范圍核酸酶，其機(jī)會(huì)實(shí)在太渺茫。其次，改進(jìn)的余地也有限。大范圍核酸酶的識(shí)別與剪切兩種功能利用同一結(jié)構(gòu)域，改造識(shí)別結(jié)構(gòu)域就會(huì)影響剪切活性，因此最終找到理想的酶是一項(xiàng)幾乎無(wú)法完成的任務(wù)?？茖W(xué)家必須尋找新的策略。

鋅指核酸酶（ZFN）

1981年從海床黃桿菌（Flavobacteriumokeanokoites）中分離得到一種傳統(tǒng)的IIS型限制性內(nèi)切酶，被命名為FokI。相對(duì)于其他限制性內(nèi)切酶，F(xiàn)okI擁有自己獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，含兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是N端的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（可特異識(shí)別5-GGATG-3），另一個(gè)為c端的DNA剪切結(jié)構(gòu)域。此特征為工程化改造提供了良機(jī)。因識(shí)別序列太短（僅5bp），天然FokI酶自然也無(wú)法應(yīng)用于基因編輯，但相對(duì)獨(dú)立的剪切結(jié)構(gòu)域倒是可以作為DNA“剪刀”，跟具有識(shí)別功能的其他結(jié)構(gòu)域聯(lián)合使用。

轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)特異識(shí)別DNA序列并促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別DNA主要通過(guò)三類(lèi)結(jié)構(gòu)域來(lái)完成，其中一類(lèi)為依賴鋅離子的鋅指結(jié)構(gòu)域（zinc finger），典型特征是大約30個(gè)氨基酸可識(shí)別3個(gè)核苷酸，最終使64種可能的核苷酸三聯(lián)體都有相應(yīng)的鋅指結(jié)構(gòu)域加以識(shí)別。研究人員可根據(jù)需要將這些鋅指結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步聯(lián)合，制造出一系列識(shí)別3的倍數(shù)核苷酸的組合體，如識(shí)別18個(gè)核苷酸理論上需6個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域串聯(lián)即可，這種特征使它們成為DNA特異識(shí)別之重要工具。

1996年，美國(guó)約翰·霍普金斯大學(xué)錢(qián)德拉西格蘭（S.Chandrasegaran）首次將三個(gè)串聯(lián)的鋅指結(jié)構(gòu)域（識(shí)別9個(gè)核苷酸）與FokI的C端內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域通過(guò)一段連接蛋白融合，制造出第一個(gè)嵌合型核酸內(nèi)切酶——鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN），并在體外證明該酶對(duì)靶DNA具特異剪切能力。此外，ZFN發(fā)揮活性時(shí)往往采用同源二聚體方式，特別是FokI核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域必須在兩端DNA均完成識(shí)別的前提下方可執(zhí)行剪切作用，從而最大限度地避免了脫靶效應(yīng)的發(fā)生。

隨后研究人員探索這種嵌合核酸酶是否也可在細(xì)胞內(nèi)對(duì)靶DNA起識(shí)別與剪切作用。2001年，首次在果蠅體內(nèi)嘗試成功，與傳統(tǒng)基因打靶技術(shù)聯(lián)用可顯著增加基因編輯效率，迅速成為基因編輯領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。

ZFN技術(shù)相對(duì)于大范圍核酸酶而言是巨大進(jìn)步，但依然存在許多不足，其中針對(duì)DNA特異性序列的鋅指結(jié)構(gòu)域的組合與設(shè)計(jì)是極大挑戰(zhàn)，導(dǎo)致技術(shù)進(jìn)展緩慢，雖取得一定成功，但很難在大部分實(shí)驗(yàn)室里普及。

轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)蛋白核酸酶（TALEN）

許多革蘭氏陰性菌在感染宿主過(guò)程中，可將自身蛋白質(zhì)注入細(xì)胞，通過(guò)影響特定基因的表達(dá)而增強(qiáng)自身的生存適應(yīng)性。2007年德國(guó)哈勒一維騰貝格大學(xué)（University of Halle-Wittenberg）的博納斯（U.Bonas）發(fā)現(xiàn)植物病原菌黃單胞菌屬（Xanthomonasgenus）可制造一種“毒力”蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)由于具有激活宿主基因表達(dá)的功能，被命名為轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)蛋白（transcription activator-like effector，TALE）。2009年，博納斯以及美國(guó)艾奧瓦州立大學(xué)的波格丹諾夫（A.Bogdanove）同時(shí)闡明了TALE激活基因表達(dá)的作用機(jī)制。TALE的結(jié)構(gòu)由三部分組成，分別為核定位序列、DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域和靶基因轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。TALE的DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域由多個(gè)單體串聯(lián)重復(fù)構(gòu)成，每個(gè)單體均含34個(gè)氨基酸，除12和13位氨基酸外其他序列完全相同，而正是這兩個(gè)氨基酸的差異決定了核苷酸識(shí)別的特異性。每一個(gè)TALE識(shí)別單體對(duì)應(yīng)于一種核苷酸，因此DNA四種堿基只需四種單體即可（遠(yuǎn)少于ZFN的64種結(jié)構(gòu)域），從而使得構(gòu)建多核苷酸識(shí)別的設(shè)計(jì)大大簡(jiǎn)化了。

隨后，研究人員將根據(jù)靶DNA序列設(shè)計(jì)的TALE單體串聯(lián)后，也通過(guò)連接蛋白與FokI的c端內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域相連，構(gòu)建出TALE核酸酶（TALE nuclease.TALEN）。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，它可以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶DNA的特異性剪切，迅速應(yīng)用于基因編輯領(lǐng)域，并先后構(gòu)建成多種模型動(dòng)物，成為一顆耀眼新星，被《自然方法學(xué)》雜志評(píng)為“2011年度方法”。

TALEN相對(duì)于ZFN的高效、簡(jiǎn)潔，獲得許多科研人員青睞。盡管在TALE單體的串聯(lián)設(shè)計(jì)方面仍存在諸多不確定性，但他們相信，問(wèn)題可以通過(guò)進(jìn)一步完善技術(shù)得到解決。就在大家對(duì)TALEN技術(shù)的前景充滿期許時(shí)，另一高效基因編輯技術(shù)橫空出世，瞬間改變了該領(lǐng)域發(fā)展走向。

RNA介導(dǎo)的DNA編輯（CRISPR-Cas9）

1987年一個(gè)日本團(tuán)隊(duì)在細(xì)菌DNA中首次意外發(fā)現(xiàn)一種特殊結(jié)構(gòu)，其中“重復(fù)序列一居間序列（spacer）-重復(fù)序列”交替出現(xiàn)。隨后發(fā)現(xiàn)此特殊結(jié)構(gòu)在原核生物中普遍存在。2002年研究人員將其統(tǒng)稱(chēng)為成簇規(guī)律性間隔短回文重復(fù)（clustered regularlyinterspaced short palindromic repeat，CRISPR）；并將序列附近的編碼基因命名為CRISPR相關(guān)因子（CRISPR-associated，Cas），推測(cè)它們參與CRISPR生物學(xué)功能。

2005年，研究發(fā)現(xiàn)CRISPR居間序列來(lái)自噬菌體或質(zhì)粒等細(xì)菌染色體以外的DNA，這一發(fā)現(xiàn)暗示了它們重要的生理功能。在借鑒真核生物RNA干擾的基礎(chǔ)上，提出了解釋CRISPR-Cas系統(tǒng)作用機(jī)制的獲得性免疫假說(shuō)：CRISPR序列可轉(zhuǎn)錄出包含居間序列的RNA，該RNA與外源DNA轉(zhuǎn)錄出的RNA互補(bǔ)形成雙鏈結(jié)構(gòu)，隨后Cas蛋白對(duì)外源RNA進(jìn)行剪切，從而達(dá)到抵御病毒入侵的目的。

2007年，法國(guó)丹尼斯克（Danisco）集團(tuán)微生物學(xué)家巴朗古（R.Barrangou）等以嗜熱鏈球菌為材料證明CRISPR-Cas確是一種細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng)。這一突破立刻引起許多科學(xué)家高度重視，因此想進(jìn)一步探索其作用機(jī)制。2008年，兩個(gè)研究小組發(fā)現(xiàn)CRISPR.Cas系統(tǒng)在發(fā)揮免疫機(jī)制的作用時(shí)確實(shí)可轉(zhuǎn)錄出RNA，即crRNA（CRISPR-related RNA）。crRNA有引導(dǎo)作用，然而它們更多識(shí)別的是DNA，而非當(dāng)初假說(shuō)認(rèn)為的RNA。Cas蛋白有核酸內(nèi)切酶活性，多種Cas蛋白聯(lián)合可特異性地剪切與crRNA互補(bǔ)的DNA而形成雙鏈斷裂。該發(fā)現(xiàn)重要性顯而易見(jiàn)，crRNA負(fù)責(zé)識(shí)別，Cas蛋白負(fù)責(zé)DNA剪切，兩者具有用于基因編輯的兩項(xiàng)基本能力。不過(guò)已發(fā)現(xiàn)的兩類(lèi)CRISPR-Cas系統(tǒng)（Ⅰ型和Ⅲ型）均較復(fù)雜，特別是進(jìn)行DNA剪切時(shí)需多個(gè)Cas9蛋白共同作用，而ZFN和TALEN都只需一種嵌合核酸酶即可，因此應(yīng)用優(yōu)勢(shì)并不明顯。

2011年，瑞典于默奧大學(xué)（Umefi University）微生物研究中心法國(guó)微生物學(xué)家沙爾龐捷（E.M.Charpentier）和同事在研究Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，crRNA參與DNA識(shí)別還需反式激活的CRISPR來(lái)源的RNA（trans-activating CRISPR-derived RNA，tracrRNA）協(xié)助。這雖會(huì)增加RNA的需求數(shù)量（而RNA操作相對(duì)容易），但執(zhí)行DNA剪切時(shí)只需一種Cas9蛋白即可。此新型CRISPR-Cas系統(tǒng)還吸引了美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校結(jié)構(gòu)生物學(xué)家杜德娜（J.A.Doudna），她與沙爾龐捷共商改造Ⅱ型系統(tǒng)。

2012年，杜德娜和沙爾龐捷聯(lián)合小組將crRNA和tracrRNA兩種RNA二合一，形成單鏈引導(dǎo)RNA（single guide RNA，sgRNA），其中crRNA部分負(fù)責(zé)與靶DNA配對(duì)識(shí)別，而tracrRNA負(fù)責(zé)維持空間結(jié)構(gòu)，在RNA指導(dǎo)的核酸酶（RNA-guided nuclease，RGN）Cas9催化下，完成對(duì)靶DNA雙鏈的特異剪切。2013年，哈佛大學(xué)的張鋒和丘齊（G.M.Church）研究小組采用這套系統(tǒng)，在細(xì)胞內(nèi)完成靶基因編輯。

CRISPR-Cas9相對(duì)于傳統(tǒng)的嵌合核酸酶技術(shù)，優(yōu)點(diǎn)顯而易見(jiàn)。首先是設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，擯棄了嵌合酶技術(shù)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域DNA識(shí)別設(shè)計(jì)理念，隨之用符合沃森一克里克配對(duì)的理念進(jìn)行sgRNA設(shè)計(jì)。其次在操作方面，傳統(tǒng)嵌合酶設(shè)計(jì)在識(shí)別結(jié)構(gòu)域后還要與核酸內(nèi)切酶剪切結(jié)構(gòu)域連接，如果有多個(gè)靶DNA的編輯，就需要多次的融合。CRISPR-Cas9在Cas9保持不變前提下只需要對(duì)sgRNA進(jìn)行操作，因此在同時(shí)進(jìn)行多基因編輯方面更顯高效。CRISPR-Cas9由于具有高效簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)便引發(fā)了一場(chǎng)基因編輯研究的熱潮，這項(xiàng)技術(shù)迅速風(fēng)靡全世界。

DNA介導(dǎo)的DNA編輯（ssDNA-Ag0）

1998年，美國(guó)法爾（A.Z.Fire）和梅洛（C.C.Mello）在合作研究線蟲(chóng)肌肉相關(guān)蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)同時(shí)注入針對(duì)該基因的正義RNA和反義RNA能起干擾基因表達(dá)的作用，此現(xiàn)象被稱(chēng)為RNA干擾（RNA interference，RNAi）。2006年，法爾與梅洛為此分享諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

RNA干擾現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，激發(fā)了隨后對(duì)其作用機(jī)制的研究。原來(lái)，雙鏈RNA首先被加工為21～23個(gè)核苷酸的雙鏈RNA，然后其中一條鏈與靶mRNA及相關(guān)因子形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencing complex，RISC），完成對(duì)mRNA的剪切，而Argonaute（Ago）蛋白是RISC的一種關(guān)鍵成分。

Ago蛋白最初在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)，由于基因突變體形態(tài)非常類(lèi)似于軟體動(dòng)物船蛸（Argonautaargo）而得名。隨后從果蠅、小鼠和人等發(fā)現(xiàn)Ago普遍存在。Ago蛋白擁有一個(gè)C端Piwi結(jié)構(gòu)域，具RNA核酸內(nèi)切酶活性，從而對(duì)靶mRNA實(shí)現(xiàn)剪切。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，不僅真核生物而且包括細(xì)菌和古菌在內(nèi)的原核生物亦普遍存在Ago蛋白。借鑒CRISPR.Cas9研究經(jīng)驗(yàn)，研究人員提出，原核生物Ago蛋白也參與細(xì)菌免疫機(jī)制，意味著也能用于基因編輯。

2014年，荷蘭瓦赫寧根大學(xué)（WageningenUniversity and Research Centre）范德奧斯特（J.van der Oost）發(fā)現(xiàn)古菌——噬熱棲熱菌（Thermusthermophilus）的Ago蛋白（TtAgo）還具有DNA核酸內(nèi)切酶活性，但和Cas9不同，TtAgo剪切靶DNA時(shí)依賴單鏈DNA（single stranded DNA，ssDNA）而不是RNA，說(shuō)明Ago蛋白是一種DNA指導(dǎo)的核酸酶（DNA-guided nuclease，DGN）。此發(fā)現(xiàn)在闡明一種新型原核生物的免疫系統(tǒng)作用機(jī)制同時(shí)，還顯示ssDNA-Ago系統(tǒng)也可應(yīng)用于基因編輯。然而，該技術(shù)的應(yīng)用前景尚待進(jìn)一步確定。鑒于三大類(lèi)生物分子DNA、RNA和蛋白質(zhì)的生物學(xué)作用特征，即DNA是遺傳信息攜帶者，蛋白質(zhì)是生物學(xué)功能具體執(zhí)行者，而RNA更多發(fā)揮中介和調(diào)節(jié)等多重生物學(xué)作用（近幾年生命科學(xué)進(jìn)展更多出現(xiàn)在RNA領(lǐng)域，包括核酶、RNA干擾等），功能多樣的RNA作為引導(dǎo)分子，可能比DNA在基因編輯方面具有優(yōu)勢(shì)。當(dāng)然，此推測(cè)需要充分的實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

基因編輯的應(yīng)用

基因編輯工具更多地引入DNA雙鏈斷裂（DSB），由于機(jī)體對(duì)DNA完整性的要求，因此隨后會(huì)啟動(dòng)修復(fù)機(jī)制。DNA修復(fù)系統(tǒng)主要有兩種類(lèi)型，分別為非同源末端連接（non-homologous end ioininz.NHEJ）和同源指導(dǎo)的修復(fù)（homology-directedrepair，HDR）。NHEJ無(wú)需同源序列，可將斷裂的雙鏈重新連接，然而在連接過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)堿基丟失或增加，最終造成基因的缺失或插入突變。HDR是在同源DNA存在前提下，以同源DNA信息為模板完成DNA斷裂處修復(fù)。如果按基因打靶策略在引入雙鏈斷裂的同時(shí)補(bǔ)充打靶序列，可實(shí)現(xiàn)精確替換，既可引入定點(diǎn)突變，又可實(shí)現(xiàn)突變基因的修復(fù)?；蚓庉嬐ㄟ^(guò)對(duì)目標(biāo)DNA的精確操作，達(dá)到控制生物性狀和行為的目的，因此擁有廣泛的應(yīng)用前景。

首先，可作為便捷的實(shí)驗(yàn)工具。實(shí)驗(yàn)室基因功能研究的快捷方法是RNA干擾技術(shù)，但RNA干擾只影響mRNA含量，并未去除基因本身，而傳統(tǒng)基因敲除由于費(fèi)事費(fèi)錢(qián)，其應(yīng)用受到限制。當(dāng)前的基因編輯技術(shù)可快速制備突變體，加快了實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)程。

其次，用于模式生物制備。用傳統(tǒng)基因打靶技術(shù)制備的模式動(dòng)物，一方面效率低，另一方面還受限于干細(xì)胞；而用最新基因編輯技術(shù)已完成大量物種的基因敲除，制備出各種特定疾病的動(dòng)物模型，并且時(shí)間大大縮短。采用CRISPR-Cas9等技術(shù)不僅能對(duì)傳統(tǒng)模式動(dòng)物如小鼠、大鼠等進(jìn)行基因編輯，還能在大型哺乳動(dòng)物如豬和牛以及猴等靈長(zhǎng)動(dòng)物中開(kāi)展基因編輯。

第三，用于物種改良。新的基因編輯技術(shù)對(duì)動(dòng)植物改良有重要意義，如借助CRISPR-Cas9完成對(duì)豬體內(nèi)病毒的去除工作等多方面的應(yīng)用。

第四，具有潛在的臨床價(jià)值。最新的基因編輯技術(shù)已在遺傳病、血液病和感染病等領(lǐng)域顯示了巨大臨床價(jià)值，還為其他疾病的診治提供了重要借鑒。當(dāng)然尚需進(jìn)一步的探索以保證應(yīng)用的安全性。

第五，用于其他領(lǐng)域。通過(guò)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的改造，可望在基因表達(dá)調(diào)控等領(lǐng)域也發(fā)揮重要作用。

基因編輯的前景

基因編輯從原理上講只有一種類(lèi)型，就是借助核酸酶實(shí)現(xiàn)DSB，但根據(jù)DNA序列特異識(shí)別機(jī)制的差異，可分為兩大類(lèi)，即嵌合酶技術(shù)（如ZFN和TALEN等）和核酸指導(dǎo)的核酸酶技術(shù)（CRISPR-Cas9和ssDNA-Ago等）。基因編輯的演變歷史也基本沿著細(xì)菌-免疫系統(tǒng)-核酸酶這一線索展開(kāi)。

由基因編輯發(fā)展歷程可見(jiàn)科學(xué)發(fā)展一般規(guī)律。第一代基因編輯為單組分（天然核酸內(nèi)切酶或人工嵌合核酸酶），第二代基因編輯為雙組分（引導(dǎo)核酸加核酸內(nèi)切酶），突破性進(jìn)展在于用精確堿基配對(duì)取代蛋白質(zhì)一DNA識(shí)別。但兩代技術(shù)均存在一個(gè)重大缺陷，就是需要原核核酸內(nèi)切酶，意味著應(yīng)用于臨床存在誘發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答的潛在危險(xiǎn)。因此推測(cè)，是否有誕生第三代基因編輯的可能？即重回單組分，但此時(shí)已不是蛋白質(zhì)而是RNA。RNA本身既具有識(shí)別作用，有時(shí)又具有核酸內(nèi)切酶活性（核酶），這樣既減少了多組分困擾，又避免了外源蛋白質(zhì)（對(duì)已有基因編輯技術(shù)必不可少）的不利影響。當(dāng)然，這想法能否實(shí)現(xiàn)還要深入研究。

基因編輯研究分四個(gè)層面，即體外實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞水平、動(dòng)物水平和臨床應(yīng)用。目前研究人員已在前三個(gè)層面取得重大突破，對(duì)其臨床應(yīng)用也充滿期待。然而。真要把基因編輯應(yīng)用于臨床，目前仍有許多問(wèn)題要解決，如怎樣提升體內(nèi)基因編輯過(guò)程中的轉(zhuǎn)染和編輯效率，怎樣避免潛在的脫靶效應(yīng)及不確定因素影響，此外還涉及倫理問(wèn)題，須進(jìn)一步完善相關(guān)技術(shù)，盡可能避免不良效應(yīng)。上面提到DSB的引入，這也意味著正常情況下細(xì)胞內(nèi)DSB發(fā)生率極低，暗示引入過(guò)多DSB對(duì)細(xì)胞可能是頗大威脅，為基因編輯安全性埋下了隱患。

總之，基因編輯技術(shù)猶如雙刃劍，我們?cè)诳吹狡淇焖侔l(fā)展和廣闊應(yīng)用前景同時(shí)，也要理性估計(jì)其應(yīng)用的得失，尤其對(duì)未來(lái)可能的臨床應(yīng)用更宜采取慎重態(tài)度。

關(guān)鍵詞：基因編輯 基因打靶 鋅指核酸酶 TALEN CRISPR-Cas9 ssDNA-Ago