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百毒殺及來蘇兒對金黃色葡萄球菌的殺菌效果比較試驗

生產(chǎn)中常用的消毒劑有百毒殺和來蘇兒，百毒殺是一種雙鏈季胺高效表面活性消毒劑，具有無色、無味、無毒和無腐蝕性，并能與水互溶特點。百毒殺是目前世界上最優(yōu)秀的雙鏈季胺鹽消毒劑之一。來蘇兒消毒劑屬酚類消毒劑，是甲酚陰離子表面活性劑、兩性表面活性劑等輔助成分組成的無色透明液體。我們通過試驗，對百毒殺和來蘇兒兩種消毒劑對金黃色葡萄球菌的殺滅效果進行比較。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1病料。本試驗采用某一死亡家禽的肺部作為病料，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2消毒劑。百毒殺和來蘇兒由天津市動物疫病預(yù)防控制中心提供。

1.1.3培養(yǎng)基。血平板培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

1.1.4設(shè)備儀器。電子天平、藥匙、錐形瓶、玻璃棒、電爐、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、恒溫恒濕培養(yǎng)箱、冰箱、平皿、試管、試管架、剪刀、移液器、接種環(huán)、載玻片、量筒，由天津農(nóng)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室提供。

1.1.5藥物和試劑。百毒殺、來蘇兒、營養(yǎng)瓊脂、氯化鈉、蛋白胨、牛肉膏、蒸餾水、革蘭氏染液、兔血瓊脂培養(yǎng)基、吐溫-80（1%）。

1.2試驗方法。試驗操作前，先將試驗所需的器材用報紙包裹好放置高壓滅菌鍋滅菌20m in，再放入無菌操作臺紫外線滅菌，然后繼續(xù)試驗。

1.2.1培養(yǎng)基的配制。固體培養(yǎng)基：用電子天平稱取42 g營養(yǎng)瓊脂放入錐形瓶，加入1 000m l蒸餾水放置電爐加熱煮沸溶解。液體培養(yǎng)基：用電子天平稱取牛肉膏1.0 g，蛋白胨2.0 g，氯化鈉1.0 g，蒸餾水200m l，放置錐形瓶中用電爐加熱煮沸溶解。以上兩種溶液配制好后用瓶塞蓋好放置高壓滅菌鍋中滅菌20min，取出放入超凈工作臺倒板，固體培養(yǎng)基倒入平皿內(nèi)，每板1/3，液體培養(yǎng)基倒入滅菌的試管，待恢復(fù)室溫待用。

1.2.2細菌的分離培養(yǎng)與鑒定。①細菌的分離培養(yǎng)。在超凈工作臺中操作，用酒精棉擦拭病料表面，取一小塊組織，使新鮮切面平整，直接接種到兔血瓊脂培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)基放入在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24 h。取出并觀察細菌的菌落形態(tài)、生長情況和溶血現(xiàn)象。放置在4℃冰箱中備用。②細菌的純化。用滅菌的接種環(huán)在經(jīng)過24 h培養(yǎng)的血瓊脂培養(yǎng)基上挑取生長菌落較小、較濕、較透明、邊緣整齊、隆起的單一的菌落，劃線接種到血瓊脂培養(yǎng)基上，倒置在37℃的恒溫培養(yǎng)基中進行純化培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h。取出培養(yǎng)基觀察菌落特征，放置4℃冰箱中備用。③菌懸液的制備。將分離出的單個菌落接種到提前制備的普通液體培養(yǎng)基中，放到37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)基的渾濁度，根據(jù)其渾濁度再培養(yǎng)12 h，制備成均勻的菌懸液。然后，拿出培養(yǎng)基置于4℃冰箱，備用。④鏡檢。用滅菌接種環(huán)從搖勻的液體培養(yǎng)基中取一環(huán)的菌液，在玻璃片的中間位置均勻地涂抹成適當(dāng)大小的薄層。待自然干燥后將其固定，然后做革蘭氏染色，革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個步驟，在顯微鏡觀察細菌的形態(tài)。染色結(jié)果：革蘭氏陽性菌都呈紫色，革蘭氏陰性菌都呈紅色。

1.2.3生化試驗。將待檢的菌株分別接種到葡萄糖、麥芽糖、乳糖、過氧化氫酶、甘醇、蔗糖培養(yǎng)基中，開口朝下，置滅菌培養(yǎng)皿中。37℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.4細菌消毒試驗。①菌落計數(shù)試驗。將菌懸液取出1m l，放入試管中，用經(jīng)過高壓滅菌的蒸餾水稀釋為10-1，，以此類推，直到稀釋到10-5，用經(jīng)過高壓滅菌的棉簽，在菌懸液中蘸取少許10-4與10-5兩種不同濃度的菌懸液，均勻的涂抹在培養(yǎng)24 h的普通瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h，數(shù)出單個菌落個數(shù)（30～300之間有效），乘以稀釋度，即為菌懸液中細菌的個數(shù)。②抑菌試驗。采用杯碟法，在超凈工作臺上，將半固體培養(yǎng)基倒在固體培養(yǎng)基表面，凝固后再輕輕的用鑷子將五個無菌牛津杯放在半固體培養(yǎng)基表面，要求分散且等距。在牛津杯中分別加入不同濃度梯度（1%、0.5%、0.25%、0.13%、0.07%）但等量（50μl）的消毒劑，做好標(biāo)記。放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，取出，觀察比較抑菌圈大小，測出并記錄各抑菌圈的直徑。③懸液定量殺滅試驗。將制成的菌懸液用移液器取50μl于EP管中（5個），分別加入450μl不同濃度的消毒劑，混勻，做好標(biāo)記。作用5～20 m in后，從中分別取出100μl于另五個EP管中，分別加入900μl中和劑吐溫-80，作用一段時間后，取出50μl并加入450μl的蒸餾水，之后進行倍比稀釋。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。倍比稀釋后，取合適的稀釋液進行涂板計數(shù)，每個稀釋液對應(yīng)兩個平板。計數(shù)時，首先選平均菌落數(shù)在30～300之間的，若在此區(qū)間之外的菌落數(shù)不予采用。

細菌殺滅率=（消毒前菌數(shù)—消毒后菌數(shù)）/消毒前菌數(shù)

2　試驗結(jié)果

2.1菌落形態(tài)。在血平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌呈金黃色，也有時為白色，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，周圍有溶血圈。在普通培養(yǎng)基上培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌生長良好。37℃、24 h，白色，光滑，不透明，半徑1～2mm。

2.2細菌形態(tài)學(xué)檢查。用滅菌接種環(huán)從搖勻的液體培養(yǎng)基中取一環(huán)的菌液，在玻璃片的中間位置均勻地涂抹成適當(dāng)大小的薄層。待自然干燥后將其固定，然后做革蘭氏染色。被檢細菌菌體呈紫色球形，革蘭氏陽性菌落。

2.3生化試驗結(jié)果。將待檢的菌株分別接種到葡萄糖、麥芽糖、乳糖、過氧化氫酶、甘醇、蔗糖培養(yǎng)基中，開口朝下，置滅菌培養(yǎng)皿中。37℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄結(jié)果。

表1　生化試驗結(jié)果

2.4細菌抑制試驗。將半固體培養(yǎng)基倒在固體培養(yǎng)基表面，凝固后再輕輕的用鑷子將五個無菌牛津杯放在半固體培養(yǎng)基表面，要求分散且等距。在牛津杯中分別加入不同濃度梯度（1%、0.5%、0.25%、0.13%、0.07%）但等量（50μl）的消毒劑，做好標(biāo)記。放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，取出，觀察比較抑菌圈大小，測出并記錄各抑菌圈的直徑，百毒殺抑菌效果相對來蘇兒效果較好，百毒殺的抑菌圈由1 cm逐漸減小到0.2 cm，而來蘇兒只有1%是有效果，且效果不太明顯，抑菌圈直徑僅為0.1 cm。

本試驗中，兩種消毒劑的抑菌效果是通過它的抑菌圈、殺菌率來體現(xiàn)的。

表2　兩種消毒劑不同濃度抑菌圈（直徑）大小　（cm）

表3　消毒劑對金黃色葡萄球菌的殺菌率

3　結(jié)論

試驗結(jié)果表明，在一定濃度下，2種消毒劑對金黃色葡萄球菌均有不同程度的作用。但不同的消毒劑殺菌效果不一樣。在一定濃度下，2種消毒劑的殺菌率隨著消毒時間與濃度的增大而增強。其中，百毒殺的效果優(yōu)于來蘇兒的殺菌效果。來蘇兒溶液殺菌效果作用較弱，在稀釋到1%時效果不太明顯，而且要達到100%滅菌效果需要的時間比其他的消毒劑要長。

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