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百毒殺及來蘇兒對金黃色葡萄球菌的殺菌效果比較試驗(yàn)

生產(chǎn)中常用的消毒劑有百毒殺和來蘇兒，百毒殺是一種雙鏈季胺高效表面活性消毒劑，具有無色、無味、無毒和無腐蝕性，并能與水互溶特點(diǎn)。百毒殺是目前世界上最優(yōu)秀的雙鏈季胺鹽消毒劑之一。來蘇兒消毒劑屬酚類消毒劑，是甲酚陰離子表面活性劑、兩性表面活性劑等輔助成分組成的無色透明液體。我們通過試驗(yàn)，對百毒殺和來蘇兒兩種消毒劑對金黃色葡萄球菌的殺滅效果進(jìn)行比較。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1病料。本試驗(yàn)采用某一死亡家禽的肺部作為病料，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2消毒劑。百毒殺和來蘇兒由天津市動物疫病預(yù)防控制中心提供。

1.1.3培養(yǎng)基。血平板培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

1.1.4設(shè)備儀器。電子天平、藥匙、錐形瓶、玻璃棒、電爐、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、恒溫恒濕培養(yǎng)箱、冰箱、平皿、試管、試管架、剪刀、移液器、接種環(huán)、載玻片、量筒，由天津農(nóng)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.5藥物和試劑。百毒殺、來蘇兒、營養(yǎng)瓊脂、氯化鈉、蛋白胨、牛肉膏、蒸餾水、革蘭氏染液、兔血瓊脂培養(yǎng)基、吐溫-80（1%）。

1.2試驗(yàn)方法。試驗(yàn)操作前，先將試驗(yàn)所需的器材用報(bào)紙包裹好放置高壓滅菌鍋滅菌20m in，再放入無菌操作臺紫外線滅菌，然后繼續(xù)試驗(yàn)。

1.2.1培養(yǎng)基的配制。固體培養(yǎng)基：用電子天平稱取42 g營養(yǎng)瓊脂放入錐形瓶，加入1 000m l蒸餾水放置電爐加熱煮沸溶解。液體培養(yǎng)基：用電子天平稱取牛肉膏1.0 g，蛋白胨2.0 g，氯化鈉1.0 g，蒸餾水200m l，放置錐形瓶中用電爐加熱煮沸溶解。以上兩種溶液配制好后用瓶塞蓋好放置高壓滅菌鍋中滅菌20min，取出放入超凈工作臺倒板，固體培養(yǎng)基倒入平皿內(nèi)，每板1/3，液體培養(yǎng)基倒入滅菌的試管，待恢復(fù)室溫待用。

1.2.2細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鑒定。①細(xì)菌的分離培養(yǎng)。在超凈工作臺中操作，用酒精棉擦拭病料表面，取一小塊組織，使新鮮切面平整，直接接種到兔血瓊脂培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)基放入在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24 h。取出并觀察細(xì)菌的菌落形態(tài)、生長情況和溶血現(xiàn)象。放置在4℃冰箱中備用。②細(xì)菌的純化。用滅菌的接種環(huán)在經(jīng)過24 h培養(yǎng)的血瓊脂培養(yǎng)基上挑取生長菌落較小、較濕、較透明、邊緣整齊、隆起的單一的菌落，劃線接種到血瓊脂培養(yǎng)基上，倒置在37℃的恒溫培養(yǎng)基中進(jìn)行純化培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h。取出培養(yǎng)基觀察菌落特征，放置4℃冰箱中備用。③菌懸液的制備。將分離出的單個(gè)菌落接種到提前制備的普通液體培養(yǎng)基中，放到37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)基的渾濁度，根據(jù)其渾濁度再培養(yǎng)12 h，制備成均勻的菌懸液。然后，拿出培養(yǎng)基置于4℃冰箱，備用。④鏡檢。用滅菌接種環(huán)從搖勻的液體培養(yǎng)基中取一環(huán)的菌液，在玻璃片的中間位置均勻地涂抹成適當(dāng)大小的薄層。待自然干燥后將其固定，然后做革蘭氏染色，革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個(gè)步驟，在顯微鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)。染色結(jié)果：革蘭氏陽性菌都呈紫色，革蘭氏陰性菌都呈紅色。

1.2.3生化試驗(yàn)。將待檢的菌株分別接種到葡萄糖、麥芽糖、乳糖、過氧化氫酶、甘醇、蔗糖培養(yǎng)基中，開口朝下，置滅菌培養(yǎng)皿中。37℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.4細(xì)菌消毒試驗(yàn)。①菌落計(jì)數(shù)試驗(yàn)。將菌懸液取出1m l，放入試管中，用經(jīng)過高壓滅菌的蒸餾水稀釋為10-1，，以此類推，直到稀釋到10-5，用經(jīng)過高壓滅菌的棉簽，在菌懸液中蘸取少許10-4與10-5兩種不同濃度的菌懸液，均勻的涂抹在培養(yǎng)24 h的普通瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h，數(shù)出單個(gè)菌落個(gè)數(shù)（30～300之間有效），乘以稀釋度，即為菌懸液中細(xì)菌的個(gè)數(shù)。②抑菌試驗(yàn)。采用杯碟法，在超凈工作臺上，將半固體培養(yǎng)基倒在固體培養(yǎng)基表面，凝固后再輕輕的用鑷子將五個(gè)無菌牛津杯放在半固體培養(yǎng)基表面，要求分散且等距。在牛津杯中分別加入不同濃度梯度（1%、0.5%、0.25%、0.13%、0.07%）但等量（50μl）的消毒劑，做好標(biāo)記。放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，取出，觀察比較抑菌圈大小，測出并記錄各抑菌圈的直徑。③懸液定量殺滅試驗(yàn)。將制成的菌懸液用移液器取50μl于EP管中（5個(gè)），分別加入450μl不同濃度的消毒劑，混勻，做好標(biāo)記。作用5～20 m in后，從中分別取出100μl于另五個(gè)EP管中，分別加入900μl中和劑吐溫-80，作用一段時(shí)間后，取出50μl并加入450μl的蒸餾水，之后進(jìn)行倍比稀釋。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。倍比稀釋后，取合適的稀釋液進(jìn)行涂板計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋液對應(yīng)兩個(gè)平板。計(jì)數(shù)時(shí)，首先選平均菌落數(shù)在30～300之間的，若在此區(qū)間之外的菌落數(shù)不予采用。

細(xì)菌殺滅率=（消毒前菌數(shù)—消毒后菌數(shù)）/消毒前菌數(shù)

2　試驗(yàn)結(jié)果

2.1菌落形態(tài)。在血平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌呈金黃色，也有時(shí)為白色，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，周圍有溶血圈。在普通培養(yǎng)基上培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌生長良好。37℃、24 h，白色，光滑，不透明，半徑1～2mm。

2.2細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查。用滅菌接種環(huán)從搖勻的液體培養(yǎng)基中取一環(huán)的菌液，在玻璃片的中間位置均勻地涂抹成適當(dāng)大小的薄層。待自然干燥后將其固定，然后做革蘭氏染色。被檢細(xì)菌菌體呈紫色球形，革蘭氏陽性菌落。

2.3生化試驗(yàn)結(jié)果。將待檢的菌株分別接種到葡萄糖、麥芽糖、乳糖、過氧化氫酶、甘醇、蔗糖培養(yǎng)基中，開口朝下，置滅菌培養(yǎng)皿中。37℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄結(jié)果。

表1　生化試驗(yàn)結(jié)果

2.4細(xì)菌抑制試驗(yàn)。將半固體培養(yǎng)基倒在固體培養(yǎng)基表面，凝固后再輕輕的用鑷子將五個(gè)無菌牛津杯放在半固體培養(yǎng)基表面，要求分散且等距。在牛津杯中分別加入不同濃度梯度（1%、0.5%、0.25%、0.13%、0.07%）但等量（50μl）的消毒劑，做好標(biāo)記。放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，取出，觀察比較抑菌圈大小，測出并記錄各抑菌圈的直徑，百毒殺抑菌效果相對來蘇兒效果較好，百毒殺的抑菌圈由1 cm逐漸減小到0.2 cm，而來蘇兒只有1%是有效果，且效果不太明顯，抑菌圈直徑僅為0.1 cm。

本試驗(yàn)中，兩種消毒劑的抑菌效果是通過它的抑菌圈、殺菌率來體現(xiàn)的。

表2　兩種消毒劑不同濃度抑菌圈（直徑）大小?。╟m）

表3　消毒劑對金黃色葡萄球菌的殺菌率

3　結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，在一定濃度下，2種消毒劑對金黃色葡萄球菌均有不同程度的作用。但不同的消毒劑殺菌效果不一樣。在一定濃度下，2種消毒劑的殺菌率隨著消毒時(shí)間與濃度的增大而增強(qiáng)。其中，百毒殺的效果優(yōu)于來蘇兒的殺菌效果。來蘇兒溶液殺菌效果作用較弱，在稀釋到1%時(shí)效果不太明顯，而且要達(dá)到100%滅菌效果需要的時(shí)間比其他的消毒劑要長。

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