林蘭蘭，黃木土，謝新民，陳　強(qiáng)，韓麗萍

(廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥劑科，廣州　510010)

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清肝解毒膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

林蘭蘭，黃木土*，謝新民，陳強(qiáng)，韓麗萍

(廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥劑科，廣州510010)

摘要：目的建立清肝解毒膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法對(duì)清肝解毒膠囊中的黃芪、大黃、赤芍和柴胡采用薄層色譜法定性鑒別；對(duì)清肝解毒膠囊中蒽醌類成分的含量采用高效液相色譜法測(cè)定，以大黃素、大黃酸和大黃酚進(jìn)行總量計(jì)算。結(jié)果薄層鑒別項(xiàng)斑點(diǎn)清晰，分離度較好，陰性無干擾。大黃素峰面積在2.864～143.2 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 9，n=7)；大黃酸峰面積在3.544～177.2 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 8，n=7)；大黃酚峰面積在3.984～199.2 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 9，n=7)。大黃酸的平均加樣回收率達(dá)99.0%，RSD為1.42%；大黃素的平均加樣回收率達(dá)99.5%，RSD為0.88%；大黃酚的平均加樣回收率達(dá)101.9%，RSD為1.99%。結(jié)論該方法專屬性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好、加樣回收符合含量測(cè)定要求。

關(guān)鍵詞：大黃；清肝解毒膠囊；薄層色譜法，HPLC

清肝解毒膠囊是由柴胡、制大黃、赤芍、黃芪等11種中藥制備而成，其功效為健脾補(bǔ)腎、清肝解毒、活血化瘀[1]，主要對(duì)乙型肝炎病毒攜帶者、病毒性肝炎等病癥有療效。為了更加全面地鑒別大黃，為制劑生產(chǎn)提供穩(wěn)定的工藝，在原有大黃酸鑒別的基礎(chǔ)上增加了對(duì)大黃素和大黃酚的鑒別，增強(qiáng)了大黃鑒別的專屬性。研究結(jié)果表明，大黃中的游離蒽醌類化合物在人體代謝中有重要的作用，尤其是在清除毒素方面的效果顯著，在腎臟病和肝功能方面的治療有著獨(dú)特的藥效[2]，本質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)增加了對(duì)產(chǎn)品中蒽醌類成分的含量測(cè)定。

1儀器與試藥

1.1儀器BP211D型電子天平(德國(guó)賽多利斯股份公司)；HWS28型電熱恒溫水浴箱(上海恒科儀器有限公司)；Agilent 1100 Series高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；KPQ-1200型超聲波清洗器(廣州科普有限公司，超聲功率為1 200 W)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

1.2試藥大黃酚(批號(hào)110796-201118)、大黃酸(批號(hào)110757-200206)、大黃素(批號(hào)110756-200110)、黃芪甲苷(批號(hào)110781-200613)、柴胡對(duì)照藥材(批號(hào)120992-201108)，以上對(duì)照品均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；清肝解毒膠囊(醫(yī)院自制，批號(hào)分別為13J07001，150226，150302)；甲醇，色譜純；水，雙重蒸餾水；其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1薄層鑒別2.1.1大黃取清肝解毒內(nèi)容物2 g，加入30 mL甲醇，置于水浴鍋上加熱回流30 min，過濾，濾液在水浴鍋上蒸干；加水20 mL溶解殘?jiān)?，過濾，濾液加3 mL鹽酸，在水浴鍋上加熱回流30 min，冷卻；轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，用乙醚振搖提取3次，每次20 mL，合并乙醚溶液，置于水浴鍋上蒸干，加入1 mL二氯甲烷溶解殘?jiān)黐3]，為供試品溶液。取對(duì)照品大黃酚、大黃素和大黃酸適量，加適量二氯甲烷試劑制得1 mL含大黃酸、大黃素、大黃酚各0.5 mg的混合對(duì)照品溶液。另制大黃陰性樣品并取其2 g，按照上述方法制備大黃陰性樣品液。按照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)實(shí)驗(yàn)，取上述樣品液10 μL、陰性液10 μL、混合對(duì)照品液5 μL，分別點(diǎn)在同一硅膠G薄層板上，展開劑為石油醚(60～90 ℃)甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上層溶液，展開，展距約為8 cm，取出，晾干，用濃氨試液熏蒸至斑點(diǎn)清晰，在肉眼可見光下檢視[4]。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，并且陰性樣品無相應(yīng)斑點(diǎn)。薄層色譜結(jié)果表明，其他藥材對(duì)大黃中大黃酸(Rf=0.23)、大黃素(Rf=0.35)和大黃酚(Rf=0.77)的鑒別無影響。見圖1。

2.1.2黃芪取清肝解毒內(nèi)容物約10 g，加30 mL甲醇，在水浴鍋上加熱回流30 min，過濾，濾液蒸干，加20 mL水溶解殘?jiān)^濾。濾液分別用30，20和10 mL水飽和的正丁醇提取 3次。合并水飽和正丁醇液，再用20，20和10 mL氨試液洗滌 3次。將正丁醇液蒸干，加1 mL甲醇溶解殘?jiān)鳛楣┰嚻啡芤?。取黃芪甲苷對(duì)照品適量制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。另制黃芪陰性樣品并取其10 g，按照上述方法制備黃芪陰性樣品溶液。按照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)實(shí)驗(yàn)，取上述供試品溶液10 μL、陰性溶液10 μL、對(duì)照品溶液5 μL，分別點(diǎn)在同一硅膠G薄層板上，展開劑為醋酸乙酯-丁酮-甲醇-水 (5∶3∶1∶1)上層溶液，展開，展距約為8 cm時(shí)取出，晾干，噴100 mL·L-1的硫酸乙醇溶液，在烘箱加熱到斑點(diǎn)清晰，檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置(Rf=0.29)上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，并且陰性樣品無相應(yīng)斑點(diǎn)。薄層色譜結(jié)果表明，其他藥材對(duì)黃芪甲苷鑒別無干擾。見圖2。

圖1大黃薄層色譜鑒別

1.陰性；2.混合對(duì)照(自下到上)大黃酸、大黃素、大黃酚；3～5.樣品(13J07001，150226和150302)

Fig.1 TLC identification of rhubard

1.negative；2.mixed reference substance (from bottom to top)rhubarb；emodin；chrysophanol；3-5.samples(13J07001，150226 and 150302)

圖2黃芪甲苷薄層色譜鑒別 1.陰性；2～4.樣品(13J07001，150226和150302)；5.黃芪甲苷

Fig.2 TLC identification ofRadixastragali1.negative； 2-4.samples(13J07001，150226 and 150302)；5.astragalus saponins

2.1.3赤芍取清肝解毒內(nèi)容物約10 g，加體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇20 mL，置于超聲儀中超聲30 min，過濾，濾液置于水浴鍋上蒸干，加20 mL水溶解殘?jiān)?，過濾。濾液分別用30，20和10 mL水飽和的正丁醇提取 3次，合并提取液，用20，20和10 mL氨試液洗滌 3次。正丁醇提取液置于水浴上蒸干，加1 mL甲醇溶解殘?jiān)?，為供試品溶液。取芍藥苷?duì)照品適量制成質(zhì)量濃度為1 mg ·mL-1的對(duì)照品溶液。另制赤芍陰性樣品并取其10 g，按照上述方法制成赤芍陰性樣品溶液。按照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)實(shí)驗(yàn)，取上述供試品溶液10 μL、陰性樣品液10 μL、對(duì)照品溶液5 μL，分別點(diǎn)在同一硅膠G薄層板上，展開劑為醋酸乙酯-丁酮-甲醇-水(5∶3∶1∶1)上層溶液，展開，展距約8 cm，取出并晾干，噴100 mL·L-1硫酸乙醇液，置于烘箱加熱至斑點(diǎn)清晰，檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置(Rf=0.66)上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，并且陰性樣品無相應(yīng)斑點(diǎn)。薄層色譜結(jié)果表明，其他藥材對(duì)赤芍鑒別無影響。見圖3。

圖3赤芍薄層色譜鑒別

1.陰性；2～4.樣品(13J07001，150226和150302)；5.芍藥苷

Fig.3 TLC identification ofRadixpaeoniaerubra1.negative; 2～4.samples(13J07001,150226 and 150302);5.herbaceous peony

2.1.4柴胡取清肝解毒內(nèi)容物約10 g，加30 mL水，置于水浴鍋上加熱回流1 h，過濾，過濾液用30，20和10 mL水飽和的正丁醇提取 3次，合并提取液，用20和10 mL氨試液洗滌 2次，將正丁醇提取液置于水浴上蒸干，加1 mL甲醇溶解殘?jiān)?，為供試品溶液。?.5 g柴胡對(duì)照藥材，按照上述方法制備對(duì)照藥材溶液。另制柴胡陰性樣品并取其10 g，按照上法制備柴胡陰性樣品溶液。按照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)實(shí)驗(yàn)，取供試品液10 μL、柴胡陰性樣品液10 μL、對(duì)照藥材液10 μL，分別點(diǎn)在同一硅膠G薄層板上展開劑為醋酸乙酯-乙醇-水 (8∶2∶1)，展開，展距約8 cm，取出并晾干，噴10 g·L-1對(duì)二甲氨基苯甲醛硫酸-乙醇(1→10)液，在70 ℃烘箱中加熱至斑點(diǎn)清晰，置于日光和紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置(Rf=0.44)上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，并且陰性樣品無相應(yīng)斑點(diǎn)。薄層色譜結(jié)果表明，其他藥材對(duì)柴胡鑒別無影響。見圖4～5。

圖4柴胡薄層色譜鑒別(日光)

1.陰性；2～4.樣品(13J07001，150226和150302)；5.柴胡對(duì)照藥材

Fig.4 TLC identification ofRadixbupleuri(sunlight) 1.negative；2-4.samples(13J07001，150226 and 150302)；5.Radixbupleurireference medicinal meterials

圖5柴胡薄層色譜鑒別(365 nm)

1.陰性；2～4.樣品(13J07001，150226和150302)；5.柴胡對(duì)照藥材

Fig.5 TLC identification ofRadixbupleuri(365 nm)

1.negative；2-4.samples(13J07001，150226 and 150302)；

5.Radixbupleurireference medicinal meterials

2.2含量測(cè)定

2.2.1色譜條件填充劑：十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動(dòng)相：甲醇-2 mL·L-1磷酸液(85∶15)；檢測(cè)波長(zhǎng)：430 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃[5]。理論塔板數(shù)按照大黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.2.2對(duì)照品儲(chǔ)備液制備分別精密稱取大黃素(110756-200110)、大黃酸(110757-200206)和大黃酚(110796-201118)對(duì)照品7.16，8.86和9.96 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得含大黃素、大黃酸和大黃酚分別為143.2，177.2和199.2 μg·mL-1的儲(chǔ)備液。2.2.3供試品溶液制備取清肝解毒內(nèi)容物3.0 g，精密稱定， 置于具塞三角瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，置于水浴鍋上加熱回流1 h，取出，放至室溫，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，立即過濾，精密移取10 mL續(xù)濾液至燒瓶中，揮干溶劑，加入稀鹽酸20 mL，超聲2 min，加入氯仿20 mL，加熱回流1 h，放冷，置于分液漏斗中，分取氯仿層，再加氯仿萃取3次，每次20 mL，合并氯仿層，揮干溶劑，用甲醇溶解殘?jiān)黐6]并定容至25 mL，即得供試品溶液。

2.2.4陰性對(duì)照溶液取不含大黃的陰性樣品3.0 g，按照供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.2.5線性關(guān)系考察精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，制成含有大黃素質(zhì)量濃度分別為2.864，5.728，14.320，22.912，28.640，34.368和143.2 μg·mL-1；大黃酸質(zhì)量濃度為3.544，7.088，17.720，28.352，35.44，42.528和177.2 μg·mL-1；大黃酚質(zhì)量濃度為3.984，7.968，19.920，31.872，39.840，47.808和199.2 μg·mL-1的對(duì)照品溶液[7]。依次加入高效液相色譜儀中，測(cè)定各峰面積。以縱坐標(biāo)為峰面積(Y)、橫坐標(biāo)為質(zhì)量濃度(X)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果：大黃素回歸方程為Y=24.409X-25.313，r=0.999 9(n=7)；大黃酸回歸方程為Y=20.963X-34.499，r=0.999 8(n=7)；大黃酚回歸方程為Y=21.779X-11.327，r=0.999 9(n=7)。結(jié)果表明，大黃素在質(zhì)量濃度2.864～143.2 μg·mL-1、大黃酸在質(zhì)量濃度3.544～177.2 μg·mL-1、大黃酚在質(zhì)量濃度3.984～199.2 μg·mL-1范圍內(nèi)，與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2.6專屬性實(shí)驗(yàn)精密量取供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μL,分別加入高效液相色譜儀中，記錄色譜圖，見圖6。從色譜圖中可見，在供試品液色譜中與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上具有相同保留時(shí)間的色譜峰，并且陰性對(duì)照溶液在此保留時(shí)間上沒有相應(yīng)的色譜峰出現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該制劑中的其他藥材對(duì)大黃酸、大黃素和大黃酚的含量測(cè)定無干擾，陰性對(duì)照溶液對(duì)大黃酸、大黃素和大黃酚的含量測(cè)定無干擾，該方法專屬性強(qiáng)。

圖6HPLC圖

A.混合對(duì)照品；B.清肝解毒膠囊樣品；C.陰性對(duì)照；

1.大黃酸；2.大黃素；3.大黃酚

Fig.6 HPLC chromatograms

A.mixed reference substances；B.the sample of Qingganjiedu Capsules；C.negative;. 1.rhubarb； 2.emodin； 3. chrysophanol

2.2.7精密度實(shí)驗(yàn)精密量取10 μL混合對(duì)照品溶液，加入高效液相色譜儀中，重復(fù)進(jìn)樣5次并測(cè)定其峰面積。結(jié)果顯示，大黃素RSD為0.06 %(n=5)，大黃酸RSD為0.19 %(n=5)，大黃酚RSD為0.08%(n=5)，表明高效液相儀器有良好的精密度。

2.2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取供試品溶液適量，分別在第0，2，4，8，12和24 h時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果顯示，大黃素RSD為1.04 %(n=6)，大黃酸RSD為1.20%(n=6)，大黃酚RSD為1.66 %(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.2.9重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取3.0 g同一批號(hào)的樣品6份(批號(hào)13J07001)，制備供試品溶液并測(cè)定其峰面積。結(jié)果顯示，樣品中大黃酸、大黃素和大黃酚的平均含量分別為0.048%，0.455%和0.112%，大黃酸RSD為1.57 %(n=6)，大黃素RSD為0.60 %(n=6)，大黃酚RSD為1.20 %(n=6)，表明本方法重復(fù)性好。

2.2.10加樣回收率實(shí)驗(yàn)分別精密稱取1 g已知含量樣品6份(批號(hào)140328)，取其中5份分別精密加入對(duì)照品大黃酸430.00 μg、大黃素2 979.20 μg和大黃酚1 000.94 μg，按照供試品溶液的制備方法制備溶液，并測(cè)定其含量，計(jì)算回收率。計(jì)算出大黃酸的平均加樣回收率達(dá)99.0%，RSD為1.42%；大黃素的平均加樣回收率達(dá)99.5%，RSD為0.88%；大黃酚的平均加樣回收率達(dá)101.9%，RSD為1.99%，表明此方法加樣回收率達(dá)到含量測(cè)定的要求。結(jié)果見表1。2.2.11樣品含量測(cè)定取3批樣品各3.0 g，精密稱定，按照供試品的制備方法制備樣品液，測(cè)其峰面積并計(jì)算本品蒽醌類的含量。3批樣品含大黃酸、大黃素和大黃酚的總量分別為0.615%，0.584%和0.610%。

表1加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 Results of recovery experiment

(n=5)

3討論

清肝解毒膠囊為我院自制藥品，本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜法對(duì)清肝解毒膠囊中的黃芪、大黃、赤芍和柴胡進(jìn)行定性鑒別，在原有只對(duì)大黃中大黃酸鑒別的基礎(chǔ)上，增加了大黃素和大黃酚的鑒別，薄層色譜結(jié)果表明，其他藥材對(duì)大黃中大黃酸(Rf=0.23)、大黃素(Rf=0.35)和大黃酚(Rf=0.77)的鑒別無影響。大黃素和大黃酚在薄層展開中斑點(diǎn)明顯并清晰可見，分離度較好，且無相互干擾，具有比較好的重復(fù)性，進(jìn)一步增強(qiáng)了大黃鑒別的專屬性，對(duì)清肝解毒膠囊的質(zhì)量具備了比較好的可控性。

在含量測(cè)定項(xiàng)中，采用HPLC法對(duì)清肝解毒膠囊的蒽醌類進(jìn)行含量測(cè)定，并進(jìn)行了方法學(xué)考察，以甲醇-2 mL·L-1磷酸(85∶15)為流動(dòng)相，分離效果好，峰形對(duì)稱，保留時(shí)間適宜，雜質(zhì)峰達(dá)到基線分離，陰性無干擾，通過方法學(xué)驗(yàn)證考察，本品的含量測(cè)定成分線性關(guān)系良好，平均回收率較高，蒽醌類成分含量的測(cè)定方法專屬性強(qiáng)、精密度高、線性關(guān)系良好，可作為清肝解毒膠囊的質(zhì)量控制方法。

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Research on the quality standard for Qingganjiedu Capsules

LIN Lanlan，HUANG Mutu*，XIE Xinmin，CHEN Qiang，HAN Liping

(Department of Pharmacy,Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command，Guangzhou 510010，China)

Abstract:ObjectiveTo establish the quality standard for Qingganjiedu Capsules. MethodsRadix Astragali，Rhubarb，Radix paeoniae rubra，Radix Bupleuri were identified by TLC. The contents of the constituents in the preparation were determined by HPLC，and the total amount of emodin，rhubarb and chrysophanol were calculated. ResultsThe spots from the test solutions on the thin layer plate were clear and the negative solution had no interference. The experiment showed good linear relationship in the range of 2.864-143.2 μg·mL-1for emodin (r=0.999 9，n=7).The experiment showed good linear relationship in the range of 3.544-177.2 μg·mL-1for rhubarb (r=0.999 8，n=7).The experiment showed good linear relationship in the range of 3.984-199.2 μg·mL-1for chrysophanol(r=0.999 9，n=7).The average recovery of rhubarb was 99.0%.RSD=1.42%.The average recovery of emodin was 99.5%，RSD=0.88%.The average recovery of chrysophanol was 101.9%，RSD=1.99%. ConclusionThe established methods are highly specific，stable， and reproducible.which can be used to control the quality of Qingganjiedu Capsules.

Key words:Rhubarb；Qingganjiedu Capsules；TLC；HPLC

(收稿日期：2015-07-17)

中圖分類號(hào)：R284

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2407(2016)03-0231-05

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.03.004

*通信作者：黃木土，男，藥師，碩士研究生

作者簡(jiǎn)介：林蘭蘭，女，藥師

基金項(xiàng)目：軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：14ZJZ15-3); 廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：201509010012)