劉繼剛， 袁　楊， 臧　蔚， 劉　昊**

(1.遵化市人民醫(yī)院 口腔科， 河北 遵化　064200； 2.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科， 河北 唐山　063000)

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·基礎(chǔ)研究·

柴胡疏肝散對(duì)抑郁大鼠海馬微管相關(guān)蛋白-2磷酸化的影響*

劉繼剛1， 袁楊2， 臧蔚2， 劉昊2**

(1.遵化市人民醫(yī)院 口腔科， 河北 遵化064200； 2.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科， 河北 唐山063000)

[摘要]目的： 探討柴胡疏肝散對(duì)抑郁大鼠海馬組織微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)磷酸化的影響。方法： 成年雄性Wistar大鼠45只，隨機(jī)均分為對(duì)照組、模型組和治療組；模型組和治療組采用慢性不可預(yù)性溫和應(yīng)激建立抑郁癥大鼠模型，治療組同時(shí)經(jīng)灌胃給予柴胡疏肝散治療，持續(xù)22 d；采用糖水實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察各組大鼠行為學(xué)變化，Western blot方法檢測(cè)各組大鼠海馬組織MAP-2及磷酸化MAP-2(pMAP-2)表達(dá)，Real-time PCR檢測(cè)pMAP-2 mRNA表達(dá)。結(jié)果： 與對(duì)照組比較，模型組大鼠糖水偏好百分比明顯降低，進(jìn)入開臂次數(shù)和停留時(shí)間百分比增高，水迷宮逃避潛伏期延長(zhǎng)，海馬pMAP-2蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，治療組大鼠糖水偏好百分比明顯增高，進(jìn)入開臂次數(shù)和停留時(shí)間百分比降低，水迷宮逃避潛伏期減少，海馬pMAP-2蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論： 柴胡疏肝散具有顯著的抗抑郁作用，該作用可能與影響海馬MAP-2磷酸化有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]柴胡疏肝散； 抑郁癥； 海馬； 微管相關(guān)蛋白； 大鼠，wistar

反復(fù)的應(yīng)激是導(dǎo)致抑郁癥(depression)發(fā)生的根本原因，其核心癥狀是興趣感缺失、記憶力減退等，抑郁癥發(fā)病率高，社會(huì)危害較大。大量研究表明，海馬神經(jīng)元體積萎縮，特別是微管相關(guān)蛋白(microtubule-associated protein 2, MAP-2)的變化可能是抑郁癥重要的病理生理過程[1-2]。中醫(yī)認(rèn)為抑郁癥是由于情志不舒，肝氣郁結(jié)所致，多采用疏肝理氣法對(duì)其進(jìn)行治療[3]。柴胡疏肝散是中醫(yī)臨床上治療肝郁證的常用方劑，能明顯改善抑郁癥的臨床癥狀，但其具體機(jī)理尚不清楚[4]。本研究建立抑郁癥大鼠模型，觀察柴胡疏肝散對(duì)大鼠行為學(xué)和海馬組織MAP-2磷酸化的影響，探討柴胡疏肝散抗抑郁作用機(jī)理。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性Wistar大鼠45只，2月齡，體重180～210 g，清潔級(jí)，由華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(SCXK京2009-0004動(dòng)物合格證號(hào))。常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)，飼養(yǎng)條件室溫18～28 ℃，濕度60%～80%。

1.1.2藥品與試劑兔抗鼠MAP-2、兔抗鼠pMAP-2抗體購自Santz Cruz公司，Western blot相關(guān)試劑購自武漢博士德生物工程有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司。柴胡疏肝散飲片由河北省中藥材公司提供，飲片按照柴胡6 g，白芍4.5 g，枳殼4.5 g，川芎4.5 g，醋炒陳皮6 g，香附4.5 g，炙甘草1.5 g組方。將各味藥清水浸泡1 h，砂鍋煎煮至沸后至少20 min，使其終濃度為每毫升藥液含原生藥1 g。

1.2方法

1.2.1分組將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和治療組，每組15只。按文獻(xiàn)[4]方法給予大鼠慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激(CUMS)制作抑郁癥大鼠模型。治療組在造模同時(shí)，給予大鼠柴胡舒肝散，每日灌胃1次(每毫升藥液含原生藥1 g，劑量1 mL/100 g體質(zhì)量)，其他兩組給予等體積生理鹽水。造模及給藥持續(xù)22 d，結(jié)束后24 h處死大鼠。對(duì)照組不作特殊處理。

1.2.2糖水偏好實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前禁止飲水2.5 h，實(shí)驗(yàn)時(shí)分別用10%蔗糖水和自來水給大鼠供飲，測(cè)量大鼠1 h內(nèi)的蔗糖水和自來水消耗量，計(jì)算糖水偏好百分比(糖水消耗量/總液體消耗×100%)。

1.2.3高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)分別將3組大鼠置于高架十字迷宮中央?yún)^(qū)，頭朝開臂。通過動(dòng)物行為視頻分析系統(tǒng)記錄分析5 min內(nèi)大鼠的活動(dòng)情況。檢測(cè)大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)百分比和在開臂滯留時(shí)間百分比。

1.2.4Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)每組取5只大鼠，利用鼠博士行為學(xué)分析系統(tǒng)進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠60 s內(nèi)找到水下平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)。

1.2.5MAP-2和pMAP-2表達(dá)Western blot檢測(cè)海馬MAP-2和pMAP-2表達(dá)。每組各取大鼠5只，麻醉后斷頭取腦，快速分離海馬，提取組織總蛋白，按照30 μg蛋白量上樣， 10% SDS-PAGE電泳，PVDF膜電轉(zhuǎn)印，脫脂奶粉封閉，MAP-2一抗(1∶500)4 ℃孵育過夜，二抗IgG(1∶5 000)室溫孵育1 h，ECL顯色，同樣方法進(jìn)行pMAP-2和內(nèi)參照β-actin的SDS-PAGE電泳和顯色。以目的條帶與內(nèi)參照的光密度比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.2.6pMAP-2 mRNA表達(dá)Real-time PCR檢測(cè)pMAP-2 mRNA表達(dá)。每組大鼠各取5只，麻醉后斷頭取腦，冰上快速分離海馬組織，提取總RAN。定量后取1 μg總RNA，按照試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR 擴(kuò)增。pMAP mRNA引物序列：sense 5′-TGG CTT TCT CAT CTC CAT CC-3′，antisense 5′-CTC ACT GCC CCA TTA GTG C-3′，產(chǎn)物大小357 bp。管家基因β-actin引物序列：sense5′-CTT CTG AGT GGC AGT GAT GG-3′，antisense 5′-TGG CAC AGT CAA GGC TGA GA-3′，產(chǎn)物大小389 bp。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 25 s(35個(gè)循環(huán))。按照公式ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(管家基因)、ΔΔCt=ΔCt(實(shí)驗(yàn)組)-ΔCt(對(duì)照組)計(jì)算2-ΔΔC t(代表pMAP-2 mRNA水平)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

糖水偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組糖水偏好百分比明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療組低于對(duì)照組，但高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，模型組大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)百分比和在開臂停留時(shí)間百分比明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療組低于對(duì)照組，高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠逃避潛伏期明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療組高于對(duì)照組，低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1　3組大鼠行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果

(1)與對(duì)照組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05

2.2海馬組織MAP-2和pMAP-2蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果表明，模型組大鼠海馬組織pMAP-2與MAP-2比值明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療組低于對(duì)照組，高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1和表2。

圖1　海馬MAP-2和pMAP-2表達(dá)(Western blot)Fig.1　Expressions of MAP-2 and pMAP-2 in hippocampus tissue detected by Western blot

組別pMAP-2MAP-2pMAP-2/MAP-2對(duì)照組0.94±0.11 1.05±0.120.90模型組0.18±0.02(1)1.18±0.200.15(1)治療組0.43±0.05(1)(2)0.71±0.08(1)(2)0.61(1)(2)

(1)與對(duì)照組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05

2.3海馬組織pMAP-2 mRNA表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果表明，模型組大鼠海馬pMAP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療組低于對(duì)照組，高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

(1)與對(duì)照組比較,P<0.05；(2)與模型組比較,P<0.05圖2　3組大鼠海馬組織pMAP-2 mRNA表達(dá)(Real-time PCR)Fig.2　Expressions of MAP-2 and pMAP-2 in hippocampus tissue detected by Real-time PCR

3討論

當(dāng)今社會(huì)，隨著生活壓力的增加，抑郁癥發(fā)病率有增高趨勢(shì)[5]。但由于抑郁癥確切發(fā)病機(jī)制尚未明確，因此對(duì)抑郁癥的治療尚缺乏有效的根治方案。中醫(yī)認(rèn)為抑郁癥是由于情志不舒，肝氣郁結(jié)所致，中醫(yī)藥對(duì)抑郁癥的療效也逐漸得到人們的認(rèn)可。中醫(yī)還認(rèn)為，抑郁癥屬“郁證”范疇，是情志不舒，肝氣郁結(jié)，漸致五臟不和，化火、生痰、瘀阻、耗氣、傷陰等而致。根據(jù)中醫(yī)對(duì)癥治療原則，中醫(yī)臨床上多采用疏肝理氣法對(duì)抑郁癥進(jìn)行治療，常用方劑之一是柴胡疏肝散[3]。柴胡疏肝散由柴胡、陳皮、川芎、香附、枳殼、芍藥、炙甘草等7味藥組成，能發(fā)揮疏肝解郁、行氣止痛作用，主治肝氣郁滯諸癥。中醫(yī)臨床研究表明，柴胡疏肝散對(duì)肝郁氣滯、氣血不合之證多有效驗(yàn)[6-8]。

本研究首先檢測(cè)了柴胡疏肝散對(duì)大鼠行為學(xué)的影響。結(jié)果顯示，與模型組比較，經(jīng)過柴胡疏肝散治療后，大鼠糖水偏好百分比、高架十字迷宮開臂次數(shù)百分比及開臂時(shí)間百分比明顯升高，Morris水迷宮逃避潛伏期顯著降低，提示柴胡舒肝散能明顯減輕抑郁癥大鼠的興趣感缺失、焦慮癥狀、記憶力減退等臨床癥狀，對(duì)抑郁癥大鼠具有較明顯的治療作用。MAP，即微管相關(guān)蛋白，能調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架微管的聚合與解離狀態(tài)，在維持神經(jīng)元形態(tài)和突觸可塑性方面發(fā)揮重要作用[9-10]。隨著影像技術(shù)的發(fā)展，對(duì)抑郁癥患者腦結(jié)構(gòu)改變的研究取得顯著進(jìn)展，能直接觀察到抑郁癥患者存在海馬部位結(jié)構(gòu)與功能異常[11]。同樣的研究結(jié)果在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也得到驗(yàn)證[12]。為進(jìn)一步探討柴胡疏肝散的作用機(jī)理，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了大鼠海馬MAP-2及其磷酸化的改變。結(jié)果表明抑郁癥大鼠海馬組織中pMAP-2與MAP-2比值顯著降低，提示MAP-2蛋白磷酸化增強(qiáng)可能是抑郁癥發(fā)病的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。這與隋竹欣等的研究結(jié)果相一致[2]。課題組進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥大鼠經(jīng)過柴胡疏肝散治療后，MAP-2蛋白磷酸化降低現(xiàn)象得到顯著逆轉(zhuǎn)，pMAP-2與MAP-2比值明顯高于模型組，但仍低于對(duì)照組(P<0.05)。mRNA水平檢測(cè)結(jié)果與蛋白質(zhì)結(jié)果相一致。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，柴胡疏肝散能影響抑郁癥海馬組織MAP-2磷酸化，這可能是其抗抑郁作用的機(jī)理之一。但使用柴胡疏肝散治療后，MAP-2蛋白磷酸化程度仍然低于對(duì)照組，提示影響MAP-2磷酸化的還有其他因素，值得進(jìn)一步研究。

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(2016-01-25收稿，2016-03-19修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 劉華

Influence of Bupleurum Liver-Coursing Powder on Phosphorylatied Microtubule-Associated Protein-2 in Hippocampus of Depressive Rats

LIU Jigang1, YUAN Yang2, ZANG Yu2, LIU Hao2

(1.DepartmentofStomatology,ZunhuaPeople'sHospital,Zunha064200,Hebei,China; 2.DepartmentofNeurology,theAffiliatedHospitalofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,Hebei,China)

[Abstract]Objective: To observe the influence of bupleurum liver-coursing powder on phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (pMAP-2) in hippocampus of depressive rats. Methods: Forty-five male Wistar rats were randomly divided into control group, model group and treatment group. The depression animal model was produced by giving the rats chronic unpredicted mild stress and treatment group received intragastric administration of bupleurum liver-coursing powder for 22 days. The sucrose preference test, elevated plus maze test and Morris water maze test were adopted to observe behavioral changes of rats in each group. The expression of pMAP-2 protein and mRNA were detected by western blot and real-time PCR respectively. Results: Compared with control group, sucrose preference percentage of model group was significantly lower, the number of entry into open arms and percentage of detention time extended significantly, the escape latency of Morris water maze test increased significantly, and the expression of pMAP-2 protein and mRNA were decreased significantly (P<0.05). Compared with model group, sucrose preference percentage of treatment was significantly higher, the number of entry into open arms and percentage of detention time decreased significantly, the escape latency of Morris water maze test decreased significantly, and the expression of pMAP-2 protein and mRNA were increased significantly (P<0.05). Conclusion: Bupleurum liver-coursing powder has a significant anti-depressant effect, and its mechanism may be relavent to its effect on the phosphorylation of MAP-2 in hippocampus.

[Key words]bupleurum liver-coursing powder; depression; hippocampus; microtubule-associated protein; rats,wistar

[中圖分類號(hào)]R285.5

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)04-0387-04

*[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金(81201048)

**通信作者 E-mail:liuhao938@163.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-04-20網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160420.1857.060.html