吳　憂， 張軍梅*

(貴州醫(yī)科大學(xué)附院 口腔科， 貴州 貴陽　550004)

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不同流體剪切力對(duì)牙周膜成纖維細(xì)胞分泌COX-2的影響*

吳憂**， 張軍梅***

(貴州醫(yī)科大學(xué)附院 口腔科， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 研究流體剪切力(FSS)對(duì)體外培養(yǎng)人牙周膜成纖維細(xì)胞(HPDLCs)分泌環(huán)氧合酶2(COX-2)蛋白的影響。方法： 體外培養(yǎng)的HPDLCs置于體外FSS加載裝置系統(tǒng)，分別加載0、5、8、12及15 r/min的FSS 1、2及6 h，免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)細(xì)胞分泌的COX-2蛋白量，分析蛋白量的灰度值。結(jié)果： HPDLCs在FSS的作用下COX-2蛋白表達(dá)增強(qiáng)，加載力為12 r/min及加載時(shí)間2 h 時(shí)，COX-2蛋白的表達(dá)達(dá)峰值。結(jié)論： 體外加載FSS可影響人HPDLCs分泌COX-2蛋白。

[關(guān)鍵詞]流體剪切力； 環(huán)氧合酶2； 牙周膜； 成纖維細(xì)胞

合適的正畸力不僅僅可以使得牙齒快速移動(dòng)，同時(shí)還能夠刺激牙槽骨、頜面部等軟硬組織發(fā)生不同程度的改建[2]。人牙周膜成纖維細(xì)胞(human periodontal ligament fibroblast，HPDLCs)對(duì)機(jī)械力的適應(yīng)性改建是牙齒移動(dòng)的生物學(xué)基礎(chǔ)[1]。研究表明,在正畸過程中，HPDLCs是最先感受到正畸力的細(xì)胞，在骨改建的過程中起到了重要的調(diào)控作用[3-4]。當(dāng)機(jī)械力引起牙周膜內(nèi)部液體環(huán)境流動(dòng)產(chǎn)生流體剪切力(fluid shear stress，F(xiàn)SS)后，機(jī)械力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換為生物力學(xué)信號(hào)，從而使得HPDLCs開始增殖及分化[5]。環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX-2)是前列腺素E2的限速酶，參與了是前列腺素E2的激活，進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞力信號(hào)作用后骨改建的發(fā)生。本研究通過使用平板腔室系統(tǒng)，對(duì)體外培養(yǎng)的HPDLCs施加FSS，觀察不同加載力值、不同時(shí)間對(duì)HPDLCs分泌COX-2的影響，為研究正畸力作用下骨組織改建提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料及方法

1.1主要試劑及器材

DMEM低糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胎牛血清( FBS)、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，Ⅰ型膠原酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，兔抗人波形蛋白和鼠抗人角蛋白購(gòu)自北京中杉金橋公司，28RS低溫高速離心機(jī)和3180FCO2培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)Heraus公司，DMIRB倒置相差顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司，細(xì)胞粒度分析及計(jì)數(shù)儀購(gòu)自美國(guó)Beck-man Coulter公司。

1.2HPDLCs的培養(yǎng)、純化及鑒定

取口腔門診12～16歲患者正畸前磨牙牙冠立即放入預(yù)冷的DMEM低糖培養(yǎng)基(含100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)中快速移至超凈臺(tái)，將牙冠取出放入75%乙醇浸泡約1 min，用PBS液反復(fù)沖洗離體牙根面去除污物及乙醇，用預(yù)先配置的含10% FBS及雙抗的DMEM低糖培養(yǎng)基潤(rùn)濕根面，刮取根中1/3牙周膜，剪成長(zhǎng)、寬、高各約為1 mm的組織塊放入15 mL的離心管中，并加入0.2%Ⅰ型膠原酶2 mL，放入CO2培養(yǎng)箱，每5 min取出搖勻，15 min后800 r/min離心3 min，將消化的組織塊接種于60 mm的培養(yǎng)皿中，加入DMEM低糖培養(yǎng)基(含100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)1～2 mL，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，再加入上述培養(yǎng)基4 mL繼續(xù)原代培養(yǎng)，每3 d換液1次。使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞，待組織塊周圍的細(xì)胞達(dá)到融合狀態(tài)時(shí)，使用探針將組織塊勾除，向培養(yǎng)皿中加入0.25%胰蛋白酶(含0.02% EDTA)4 mL，于37 ℃培養(yǎng)箱中消化4～5 min后加入雙倍的完全培養(yǎng)基終止消化，移液槍吹打皿底使細(xì)胞脫落后收集于15 mL的離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入含15% FBS完全培養(yǎng)基5 mL，將細(xì)胞吹打至重懸后接種于培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)及純化，每4～5 d換液1次。取第4代細(xì)胞通過免疫組化檢查進(jìn)行細(xì)胞鑒定。

1.3繪制HPDLCs生長(zhǎng)曲線

取生長(zhǎng)至第4代的HPDLCs，使用0.25%的胰蛋白酶消化，離心后棄去上清液，加入含20% FBS的培養(yǎng)基后重懸細(xì)胞，以2×105個(gè)/mL的量接種于24孔板中，放入培養(yǎng)箱，每2 d對(duì)細(xì)胞進(jìn)行1次換液，后每24 h消化3孔對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取3孔細(xì)胞計(jì)數(shù)的平均值進(jìn)行計(jì)數(shù)，連續(xù)計(jì)數(shù)7 d，根據(jù)得到的細(xì)胞計(jì)數(shù)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖。

1.4體外加載FSS

取培養(yǎng)至第5代的HPDLCs接種于載玻片上，放于加力裝置流動(dòng)腔室的預(yù)備槽中，通過調(diào)節(jié)蠕動(dòng)泵上的流速對(duì)細(xì)胞施加不同的FSS(0、5、8、12及15 r/min)，加載時(shí)間分別為1、2及6 h。

1.5檢測(cè)HPDLCs中COX-2

取出載玻片，PBS振洗，依次予4%多聚甲醛固定30 min、3% H2O2去離子水孵育、滴加封閉血清孵育、滴加稀釋的COX-2一抗工作液、4 ℃過夜，SP1000通用型二抗，室溫孵育4 h，滴加新鮮配置的DAB顯色劑(DAB底物液1 mL加DAB濃縮液50 μL，混合均勻)，在室溫下置暗處，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，沖洗。酒精逐級(jí)脫水，充分干燥，樹膠封片，倒置顯微鏡下觀察COX-2蛋白顆粒染色情況，選取較為清晰的視角使用成像設(shè)備拍照用于分析其灰度值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

免疫組化標(biāo)本經(jīng)image-pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野測(cè)定其灰度值，灰度值<250為陽性。數(shù)據(jù)采用SPSS10．5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩兩比較采用單因素方差分析中最小顯著差異法(LSD)及單因素多水平方差分析(SNK)，以P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞鑒定

對(duì)第4代培養(yǎng)HPDLCs細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色顯示，抗波形蛋白呈陽性(細(xì)胞內(nèi)可見大量棕黃色顆粒)及抗角蛋白呈陰性(細(xì)胞內(nèi)未見顆粒，蘇木素染色呈淡藍(lán))，可鑒定為HPDLCs。見圖1。

2.2HPDLCs生長(zhǎng)曲線

以細(xì)胞計(jì)數(shù)作為縱軸，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為橫軸繪制HPDLCs生長(zhǎng)曲線。從第3天開始，HPDLCs細(xì)胞的增殖速度明顯加快，進(jìn)入到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，到第7天HPDLCs細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到頂峰。見圖2。

波形蛋白(免疫組化)　　　　　　　　　　　　角蛋白(蘇木素)圖1　牙周膜HPDLCs細(xì)胞中波形蛋白及角蛋白表達(dá)Fig.1　Vimentin and learatin expression in HPDLCs

圖2　牙周膜HPDLCs生長(zhǎng)曲線圖 Fig.2　Grouth curre of HPDLCs

2.3HPDLCs中COX-2表達(dá)

HPDLCs的COX-2表達(dá)因加力的大小與時(shí)間不同而不同，未加力組HPDLCs染色后無陽性顆粒顯色,而加力組均呈現(xiàn)不同程度的陽性反應(yīng)，鏡下可見COX-2均分布于 HPDLCs胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒存在。4組加力組(5、8、12及15 r/min)加力1 h后，均可見細(xì)胞中有少許陽性顆粒出現(xiàn)；加力2 h后，細(xì)胞中的棕色顆粒逐漸加深，數(shù)量也在增多，其中12 r/min組中陽性率較高，染色顆粒呈深棕色；當(dāng)加力到6 h后，陽性顆粒較2 h時(shí)淺且呈降低態(tài)勢(shì)，其中15 r/min組的細(xì)胞因加力時(shí)間過長(zhǎng)、力值過大，使得細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，由正常的長(zhǎng)梭形皺縮成偏圓形，見圖3。不同加載力及不同時(shí)間 HPDLCs的COX-2灰度值明顯不同，加載1 h時(shí)，加載力8 r/min的灰度值最高，其次為15 r/min和5 r/min，12 r/min的灰度值最低；加載2 h時(shí)，5 r/min的灰度值最高，其次為15 r/min和8 r/min，12 r/min的灰度值最低；加載6 h時(shí)，8 r/min和15 r/min的灰度值為最高值，5 r/min的灰度值表達(dá)最低。見表1。

圖3　不同程度加力及時(shí)間HPDLCs胞質(zhì)中COX-2表達(dá)Fig.3　The expression of COX-2 in different stress and time in the cytoplasm of HPDLCs

加載力(r/min)加載不同時(shí)間HPDLCs中COX-2的灰度值1h2h6h5174.36±1.36 162.81±1.38182.78±1.948188.52±1.65(1)155.84±1.16(1)194.02±1.12(1)12158.48±1.16(1)(2)113.25±1.82(1)(2)187.21±1.32(1)(2)15183.08±1.29(1)(2)(3)157.31±1.48(1)(2)(3)194.14±1.44(1)(3)

(1)與5 r/min比較、(2)與8 r/min比較及(3)與12 r/min比較，P<0.01

3討論

在錯(cuò)頜畸形矯治的過程中，牙齒移動(dòng)的基礎(chǔ)是牙周組織的重塑與改建，HPDLCs位于牙周膜中，介于牙齒與牙槽骨之間，在正畸過程中是最先感受到力的細(xì)胞[4],通過一些生物化學(xué)信號(hào)的傳遞開始骨改建。在機(jī)械力的刺激下，HPDLCs做出相應(yīng)的應(yīng)答，李曉彤等[6]的研究表明，體外對(duì)HPDLCs施加機(jī)械力，可以檢測(cè)出成骨樣細(xì)胞蛋白的表達(dá)，提示HPDLCs在機(jī)械力誘導(dǎo)下向成骨樣細(xì)胞分化成熟，從而在正畸力介導(dǎo)的骨改建中發(fā)揮作用，調(diào)控牙槽骨的形成或吸收。本研究以HPDLCs作為研究對(duì)象，檢測(cè)其在受到機(jī)械應(yīng)力時(shí)的增殖、分化以及主要參與骨改建蛋白的變化，為力學(xué)信號(hào)在牙周膜中傳導(dǎo)機(jī)制及骨改建提供參考。有實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)正畸力通過牙齒傳導(dǎo)到牙周組織上時(shí)，牙周組織會(huì)釋放出各種大分子蛋白、酶參加骨改建，已知的有前列腺素E2、IL-1等[7-8]。前列腺素E2是一種非飽和脂肪酸，它可以通過自分泌和旁分泌的方式，與牙周膜細(xì)胞進(jìn)行相互作用，在其不同濃度的情況下，促進(jìn)破骨過程或成骨過程，使兩種狀態(tài)達(dá)到一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，從而參與牙槽骨的改建。COX-2是花生四烯酸(AA)合成前列腺素E2的限速酶，參與了前列腺素E2的激活，進(jìn)而介導(dǎo)了細(xì)胞力信號(hào)作用后骨改建的發(fā)生。研究證明，COX-2和前列腺素E2是機(jī)械應(yīng)力刺激骨改建所必需的，選擇性抑制COX-2表達(dá)，可以阻斷機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的體內(nèi)骨的形成；在生理過程中，HPDLCs不分泌COX-2，而對(duì)體外培養(yǎng)的HPDLCs施加FSS，可以促使HPDLCs分泌COX-2[9]。

體外培養(yǎng)細(xì)胞的力學(xué)實(shí)驗(yàn)根據(jù)不同的施加方式，可分為：壓力載荷法、機(jī)械拉伸法、流體剪切法和離心力培養(yǎng)法等[10-14]。Schwarz[15]認(rèn)為牙周膜組織是個(gè)連續(xù)的液態(tài)環(huán)境，組織液即細(xì)胞物質(zhì)交換的媒體又是傳遞和緩沖應(yīng)力的介質(zhì)。當(dāng)牙齒受力發(fā)生位移時(shí)，必然擠壓牙周膜引起組織液的液壓迅速改變。有學(xué)者認(rèn)為，細(xì)胞對(duì)FSS的反應(yīng)比對(duì)壓力及牽張力的反應(yīng)敏感得多，細(xì)胞對(duì)外力的反應(yīng)是因?yàn)橥饬?dǎo)致組織間液流動(dòng)改變，從而被細(xì)胞感知[16]。FSS具有明確而恒定的方向性，使得受力的細(xì)胞發(fā)生相應(yīng)的排列改變[17]。靜壓力由于沒有明顯的方向性，所以不能改變細(xì)胞的排列方向。周期性牽張力的動(dòng)態(tài)效果也造成細(xì)胞貼壁不牢，細(xì)胞骨架收縮，細(xì)胞體積變小[18]。就牙周的應(yīng)力環(huán)境來看，體外施加FSS更能模擬整個(gè)牙移動(dòng)時(shí)牙周膜所受到的機(jī)械力。本研究使用的流體剪切力加力裝置通過精密的計(jì)算，可將加載的流體轉(zhuǎn)算轉(zhuǎn)換成離體細(xì)胞所受到的具體力值大小。通過對(duì)體外培養(yǎng)的HPDLCs施加不同大小和不同加載時(shí)間的FSS，檢測(cè)HPDLCs中COX-2蛋白的表達(dá)變化，以尋找誘導(dǎo)HPDLCs在牙移動(dòng)的整個(gè)骨改建過程中發(fā)揮作用的最佳作用力值和產(chǎn)生作用時(shí)間，加載力為12 r/min、加載時(shí)間2 h時(shí)，COX-2蛋白的表達(dá)最高，通過公式平均剪切力τ= 6ηQ/h2w計(jì)算得出FSS為46.00 g。46.00 g，2 h 的加載條件有利于研究HPDLCs在正畸牙移動(dòng)的整個(gè)骨改建過程中的作用，為研究正畸力作用下骨組織改建提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(2016-01-15收稿，2016-03-28修回)

中文編輯： 戚璐； 英文編輯： 劉華

Effect of Different Fluid Shear Stress on Protein Expression of COX-2 Secreted by HPDLCs

WU You, ZHANG Junmei

(DepartmentofStomatology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To explore the effect of fluid shear stress (FSS) on the cyclooxygenase2 (COX-2) secreted by human periodontal ligament fibroblast (HPDLC) cultured in vitro. Methods: The HPDLCs cultured in vitro were placed in flow chamber system of fluid shear stress (FSS) and 0, 5, 8, 12 and 15 r/min of fluid shear stress were applied to HPDLCs for 0 h, 1 h, 2 h and 6 h, respectively. The immunohistochemistry was used to detect the expression level of COX-2 protein secreted by HPDLCs, and gray value of protein quantity was analyzed. Results: Under the action of fluid shear stress (FSS), expression of COX-2 protein in human periodontal ligament fibroblast (HPDLF) was enhanced. And when 12 r/min was applied for 2 h, the expression level of COX-2 protein reached the peak. Conclusion: The application of fluid shear stress (FSS) in vitro can affect the expression of COX-2 protein secreted by human periodontal ligament fibroblast (HPDLF).

[Key words]fluid shear stress; cyclooxygenase 2; periodontal ligament; fibroblast

[中圖分類號(hào)]R783.5

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)04-0441-05

*[基金項(xiàng)目]貴陽市科技局基金[筑科合同(20151001)]

**貴州醫(yī)科大學(xué)2013級(jí)碩士研究生

***通信作者 E-mail:zjm46688@126.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-04-20網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160420.1834.040.html