鄧　雯， 孫茂鋼， 趙　艷， 趙厚育

(1.貴州醫(yī)科大學， 貴州 貴陽　550004; 2.貴州醫(yī)科大學 分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽　550004; 3.貴州醫(yī)科大學附院 耳鼻咽喉科， 貴州 貴陽　550004)

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納米載體介導沉默Survivin基因對鼻咽癌細胞增殖凋亡及放療敏感性的影響*

鄧雯1， 孫茂鋼1， 趙艷2， 趙厚育3**

(1.貴州醫(yī)科大學， 貴州 貴陽550004; 2.貴州醫(yī)科大學 分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽550004; 3.貴州醫(yī)科大學附院 耳鼻咽喉科， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 探討納米載體轉染沉默鼻咽癌CNEII細胞中Survivin基因后，CNEII細胞增殖、凋亡及對放療敏感性的改變。方法： 制備聚乙烯亞胺(PEI)-四氧化三鐵(Fe3O4)磁性納米粒，用PEI-Fe3O4磁性納米粒包被miRNA-Survivin質粒(納米干擾質粒)，將CNEII細胞分為空白對照組(不加質粒，C組)、加納米干擾質粒組(S組)及加miRNA-NC對照質粒組(NC組)；3組細胞轉染48 h后，熒光顯微鏡下觀察質粒所帶綠色熒光蛋白EGFP的表達，進行細胞計數，計算轉染效率；利用Real Time RT-PCR及Western Blot方法檢測Survivin mRNA及蛋白表達抑制情況；轉染24、48、72及96 h時用MTT法檢測3組細胞的增殖情況，轉染48 h時用放射線照射3組，采用流式細胞術檢測3組細胞放射線照射前后的細胞凋亡率。結果： 轉染48 h后，加入包被miRNA-Survivin質粒的PEI-Fe3O4磁性納米粒的CNEII細胞轉染效率為(60.9±3.9)%、mRNA表達抑制率為96.5%、蛋白表達抑制率為82.5%，均高于C組和NC組(P<0.05)，說明構建PEI-Fe3O4磁性納米粒成功；MTT結果顯示48 h以后S組細胞的吸光度值低于NC組和C組，說明細胞增殖被抑制；轉染48～72 h CNEII細胞施以6Gy的放射線照射，射線照射后S組細胞凋亡率高于S組照射前(P<0.05)，S組細胞凋亡率高于NC組和C組(P<0.05)。結論： 鼻咽癌CNEII細胞沉默Survivin基因后的細胞的增殖被抑制、凋亡數增加，放射線照射凋亡更明顯。

[關鍵詞]鼻咽癌； Survivin基因； 細胞增殖； 細胞凋亡； 放療敏感性

鼻咽癌是中國常見的惡性腫瘤之一，以南方地區(qū)為主，是頭頸部惡性腫瘤的首位。目前臨床上放射治療鼻咽癌多采用調強放射治療，患者的5年生存率為70%[1]，但仍有部分患者經放射治療后不能得到滿意效果，如何提高鼻咽癌的放射敏感性已成為目前臨床治療的難點和研究的重點。凋亡相關基因的異常表達不僅與細胞惡性轉化和腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預后有關，而且在輻射誘導的凋亡中也可能扮演著重要的角色。Survivin是凋亡抑制蛋白家族中一員，Survivin的表達過度會使細胞失去正常細胞周期的調控限制而大量無限增殖，正常的細胞增殖與凋亡之間的平衡被打破，造成細胞凋亡減少。由于Survivin特異性表達于惡性腫瘤組織且具有強大的抑制凋亡活性，已成為倍受關注的抗腫瘤治療的靶點[2]。本研究采用新型非病毒載體聚乙烯亞胺(poly ethylene imine,PEI)-四氧化三鐵(Fe3O4)磁性納米粒介導沉默鼻咽癌CNEII細胞中的survivin基因，觀察沉默后CNEII細胞的凋亡、增殖及放療敏感性的變化，為鼻咽癌的基因治療提供一定實驗依據。

1材料與方法

1.1質料、試劑及儀器

干擾質粒購于上海吉瑪公司，miRNA-HIF-1α干擾質粒的靶序列為5′-AAGGATTTAGGCCACTGCCTT-3′，NC對照質粒的靶序列為5′-AAATGTACTGCGCGTGGAGAC-3′，各質粒均帶有EGFP綠色熒光；鼻咽癌細胞株CNEII由上海復旦大學亓立峰教授實驗室贈與。試劑有FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、PEI購于上海朗順化工有限公司，RP1640培養(yǎng)液、胎牛血清購于Invitrogen公司，Survivin抗體、Tubulin抗體及相關二抗均購于美國ABcam公司，小RNA(microRNA,miRNA)干擾質粒購于上海吉瑪公司，PCR試劑盒購于Invitrogen公司，AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒購于碧云天公司，四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑購于Sigma公司。儀器有恒溫水浴鍋，電子稱量器，機械攪拌器購于德國Memmert公司，電泳儀及垂直電泳槽購于美國BioRad公司，熒光顯微鏡購于OLYMPUS公司，高速離心機購于Eppendorf公司，RT-PCR儀購于美國Biorad公司，流式細胞儀購于BD公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與分組將CNEII細胞加入含有10%胎牛血清的RP1640培養(yǎng)液中，于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。將培養(yǎng)好的CNEII細胞分為空白對照組(不加質粒，C組)、加合成的納米顆粒PEI-Fe3O4轉染miRNA-Survivin干擾質粒組(S組)及轉染miRNA-NC對照質粒組(NC組)；在細胞生長良好的情況下，以約1×105密度接種于6孔板中，待細胞完全貼壁，密度達40%時利用轉染介質轉染相應質粒。

1.2.2PEI-Fe3O4納米載體的制備取8 mmoL 水楊酸與10 mL水混合，用1 mol/L NaOH中和水楊酸，并調PH值為11。稱取FeCl20.254 g，FeCl30.65 g，分別溶于5 mL水。將FeCl2、FeCl3溶液加入到配置好的水楊酸溶液中，溶液變成黑色，在氮氣保護，冷凝回流，機械攪拌，90 ℃條件下反應4 h。吸取PEI 6.0 g，用10 000透析袋透析2 d，每4～5 h換1次水，透析除去雜質。最后收得25 000 PEI 9.25 mmol/L。取PEI 10 mmol/L：Fe3O41 mol/L等體積渦旋混勻，即得PEI-Fe3O4納米載體。

1.2.3轉染效率轉染48 h后，熒光顯微鏡下觀察質粒所帶綠色熒光蛋白EGFP的表達，進行細胞計數，計算轉染效率。

1.2.4轉染后Survivin mRNA表達抑制率采用Real Time RT-PCR，設計Survivin基因擴增引物，上游序列為5′-ACCGCATCTCTACATTCAAG-3′，下游序列為5′-TTGAAGCAGAAGAAACACTG-3′。CNEII細胞轉染72 h收集細胞，提取總RNA，以β-actin作為對照。RT-PCR反應條件為：95 ℃ 1 min，95 ℃ 10 s、 60 ℃ 10 s、70 ℃ 10 s共40個循環(huán)；70 ℃ 10 min。實時熒光定量檢測轉染后Survivin mRNA表達，計算抑制率，抑制率=(C組2-ΔΔCT值-S組2-ΔΔCT值)/C組2-ΔΔCT值×100%。

1.2.5轉染后Survivin蛋白表達抑制率采用Western Blot法檢測，在轉染后72 h收集細胞，常規(guī)PBS洗滌后提取蛋白，12%及8%聚丙酰胺凝膠恒壓分離蛋白，常規(guī)轉膜及封閉后加入Survivin一抗(1∶5 000)和Tubulin(內對照)一抗(1∶5 000)4 ℃過夜孵育，經過常規(guī)TBST洗滌后加入相應二抗室溫孵育1 h，顯影、定影、洗滌后觀察結果，計算抑制率，抑制率=(C組相對灰度值-S組相對灰度值)/C組相對灰度值×100%。

1.2.6轉染后CNEII細胞的增殖采用MTT法，培養(yǎng)對數生長期的CNEII細胞，PBS溫柔清洗3次，用適量胰酶消化，1640全培養(yǎng)基重懸后，計數細胞，每孔按5×103細胞密度接種于96孔板上，培養(yǎng)基100 μL，于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每組設置3個復孔，質粒用量0.2 μg，納米材料25000 PEI-Fe3O4用2 μL。轉染6 h后換液，放入細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，轉染24 h后棄去培養(yǎng)基，用PBS溶液清洗細胞2遍后，加入含MTT的培養(yǎng)液。每孔加入MTT染色液50 μL，放入細胞培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)4 h。后每孔加入DMSO 100 μL，在搖床上輕輕振蕩20 min。放入酶標儀中，在570 nm處測定吸光度值。利用吸光度值反映CNEII細胞的增殖(吸光度值越高細胞增殖越好)。

1.2.7細胞凋亡采用流式細胞術，轉染48～72 h的CNEII細胞，PBS清洗3次，用適量不含EDTA胰酶消化1 min，加入含10%FBS 的RP1640培養(yǎng)基，輕輕吹打后收集細胞，2 000 r/min離心5 min，棄上清后在洗滌細胞1次，將剩下的細胞用5 00 μL binding buffer 重懸。加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入10 μL Propidium lodide，混勻。室溫避光5～15 min，1 h內流式細胞儀CNEII細胞凋亡情況。

1.2.8放射線照射細胞后CNEII細胞凋亡轉染48～72 h CNEII細胞用 6Gy的放射線照射，按1.2.6步驟檢測CNEII細胞凋亡情況。

1.3統(tǒng)計學方法

2結果

2.1構建PEI-Fe3O4磁性納米粒的鑒定

轉染48 h后，加入納米粒干擾質粒的CNEII細胞轉染效率為(60.9±3.9)%、mRNA表達抑制率為96.5%(表1)、蛋白表達抑制率為82.5%(圖1)，均高于C組和NC組(P<0.05)，說明構建PEI-Fe3O4磁性納米粒成功。

表1　MTT法測定3組CNEII細胞吸光度值

(1)與S組比較，P<0.05

圖1　3組CNEII細胞轉染48 h時Survivin蛋白表達Fig.1　Survivin protein levels of CNEII cells in the three groups after transfection for 48 h

2.2轉染后CNEII細胞的增殖

分別用miRNA-Survivin、miRNA-NC質粒轉染鼻咽癌CNEII細胞，S和NC組吸光度低于C組，從48 h開始，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。S組降低最明顯，與C組及NC組對比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.3轉染后細胞凋亡

3組轉染CNEII細胞在未用放射線照射時， C組、NC組及S組的凋亡率分別為(7.3±1.7)%、(9.4±1.5)%、(18.4±2.6)%。S組凋亡率高于與NC組和C組，差異存在統(tǒng)計學意義(P<0.05)。放射線照射后，C組、NC組、S組的凋亡率分別為(20.3±3.3)%、(19.4±4.5)%、(75.3±4.1)%；S組高于NC組和C組，差異存在統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

圖2　3組CNEII細胞轉染后MTT法測定生長曲線Fig.2　Growth curves of CNEII cells detected by MTT in three groups

3討論

正常組織的內部平衡需要嚴格準確的細胞凋亡及細胞增殖二者之間的平衡，為了達到這樣的平衡，一個龐大的基因網絡需要相互協(xié)作才能維持。腫瘤的形成大部分是由于異常的基因活躍后使細胞增殖超過細胞凋亡且賦予這些細胞不受控制的分化的能力[3]。作為凋亡抑制蛋白家族成員，Survivin在腫瘤的基因治療中一直備受關注。Survivin基因具有細胞周期性及腫瘤特異性，即在腫瘤細胞中特異性的表達，已有研究證實在臨床病例中，宮頸癌的病人病變組織中Survivin的含量顯著高于正常宮頸組織[4]。對44例施行放射線治療的子宮頸癌病人的組織切片的免疫組化分析顯示，組織切片中Survivin高表達的病人5年生存率更低[5]。提示Survivin基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。在胰腺癌細胞系中，Asanuma等[6]首次報道了Survivin mRNA的表達量與胰腺癌細胞對放射線治療的敏感性呈負相關，另外，施之不致細胞致死的放射線劑量照射后，細胞中Survivin的表達增加，這些結果為Survivin與放射治療敏感性之間的研究奠定了基礎。這也與本研究設計的初衷一致，一方面著眼于沉默Survivin對鼻咽癌細胞的凋亡增殖影響，另一方面更著重于觀察沉默Survivin后的鼻咽癌細胞對放射線的敏感性是否有變化。Survivin的抗凋亡機制主要是通過直接或間接抑制Caspase活性而發(fā)揮抗凋亡作用[7]。本實驗中在分子水平即將Survivin mRNA水平敲低，蛋白水平再次驗證其敲除效果，以期從根本降低Survivin蛋白的表達，觀察后發(fā)現鼻咽癌細胞的增殖被抑制，凋亡增加，肯定了Survivin作為抗癌靶點的突出效用。已經發(fā)現，人的Survivin基因啟動子之中含3個細胞周期依賴性因子(cellcycle-dependent，CED)和1個細胞周期同源性區(qū)域(cellcyclehomologyregion，CHR)，CDE和CHR是特異性存在于G2/M期的表達基因。所以，Survivin的表達有明顯的細胞周期性，即在細胞周期的G2/M期選擇性的表達[8]。缺氧和放射線能夠引起腫瘤細胞的G2/M期阻滯，由此可能造成放射線照射后細胞中Survivin蛋白表達量增高，腫瘤細胞凋亡減少，從而造成瘤體對放射線的敏感性下降。在結腸癌的研究中，結腸癌細胞系SW480(對放射治療低敏感性)及SW48(對放射線治療高敏感性)的兩株細胞比較，Survivin在SW480細胞系中高表達且用放射線照射該細胞后Survivin反應性上調，而在SW48中Survivin低表達且用放射線照射后Survivin并沒有反應性上調[9]。另有研究報道，進行單獨放療的4例病人及放化療一體的14例病人的原代鼻咽癌細胞中，NF-κB和Survivin的高表達和腫瘤細胞凋亡減少相關，在使用RNAi抑制Survivin的表達后再輔以6Gy的放射線照射治療，腫瘤細胞的凋亡明顯增加[10]。本實驗中光鏡下可觀察到細胞接受放射線照射后明顯膨脹，部分死亡，大部分細胞不能維持完整性，在流式細胞檢測圖上亦可證實。在施以放射線照射后，S組凋亡率較放射線照射前明顯增加，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，結果與所報道相一致，也為Survivin作為臨床使用增加放療敏感的靶點基因增加了體外實驗的依據。

注：A為放射線照射前，B為放射線照射后，橫坐標為FITC通道綠色熒光值，縱坐標為PI通道紅色熒光值圖3　轉染并經放射線照射前后3組CNEII細胞的凋亡率Fig.3　Apoptosis rate of CNEII cells in three groups after exposure to radiation

本實驗中轉染載體采用低毒性、無免疫原性的納米顆粒，較之病毒載體及傳統(tǒng)Lipofectamine在體內實驗中有更好的適應性[11]，已在前期實驗中成功證實其轉染可行性，加之本次研究結果，為提高鼻咽癌CNEII細胞對放射線敏感性的體內實驗奠定了良好的基礎。

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(2016-01-15收稿，2016-04-06修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 周凌

Effects of Silencing Survivin Gene via Nanoparticles Technique on Proliferation and Apoptosis and Radiosensitivity of Nasopharyngeal Carcinoma Cell

DENG Wen1， SUN Maogang1， ZHAO Yan2， ZHAO houyu3

(1.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.TheKeyLaboratoryofMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.DepartmentofOtorhinolaryngology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550000,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the effects of Silencing Survivin gene via nanoparticles technique on proliferation, apoptosis and radiosensitivity of nasopharyngeal carcinoma cells (CNEII). Methods: PEI-Fe3O4 magnetic nanoparticles were prepared. miRNA-Survivin plasmid was coated with PEI-Fe3O4 magnetic nanoparticles. CNEII cells were divided into blank control group (without plasmid, group C), nanoparticle interfering plasmid group (group S) and miRNA-NC plasmid control group (group NC). Fluorescence microscope was used to measure efficiency of transfection after 48 hours. Survivin protein was detected by Western blot and mRNAs were detected by RT-PCR. Cell proliferation was detected by MTT 24, 48, 72, 96 h after transfection; all groups were exposed to X ray after transfection at 48 h and cell apoptosis was analyzed by flow cytometry. Results: The transfection rate of miRNA-Survivin plasmid coated with PEI-Fe3O4 nanoparticles into CNEII cells was (60.9±3.9)%. The suppression ratio of Survivin protein and mRNA was 82.5% and 96.5% respectively in group S, which was lower than that of group C and group NC, indicating that PEI-Fe3O4 was successfully constructed. MTT showed that absorbance value of group S was lower than that in group C and group NC, which indicating that the proliferation of CNEII was inhibited. The ratio of cell apoptosis of group S exposed to 6 Gy was higher. The difference of Group S with Group NC and Group C was significant (P<0.05). Conclusion: Proliferation of transfected cells is inhibited while apoptosis rate is increased and even more obvious when exposed to radiation.

[Key words]nasopharyngeal carcinoma; Survivin gene；cell proliferation；apoptosis；radiosensitivity

[中圖分類號]R34-33; R739.6

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)04-0377-05

*基金項目]國家自然科學基金地區(qū)科學基金項目(NO.81260353)

**通信作者 E-mail:zhaohouyujia@163.com

網絡出版時間：2016-04-20網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160420.1751.006.html