夏江寶， 邢曉華， 王英超， 沈佐君

(1. 蚌埠醫(yī)學院醫(yī)學檢驗系， 安徽 蚌埠　233030； 2. 福建省聯(lián)合創(chuàng)新重點實驗室， 福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院， 福建 福州　350025； 3. 安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院， 安徽省臨床檢驗中心， 安徽 合肥　230001)

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無標記定量蛋白質(zhì)組學分析AMACR過表達對肝癌細胞生物學行為的影響

夏江寶1, 2， 邢曉華2， 王英超2， 沈佐君3

(1. 蚌埠醫(yī)學院醫(yī)學檢驗系， 安徽 蚌埠233030； 2. 福建省聯(lián)合創(chuàng)新重點實驗室， 福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院， 福建 福州350025； 3. 安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院， 安徽省臨床檢驗中心， 安徽 合肥230001)

摘要：研究α-甲?；o酶A消旋酶(AMACR)過表達對肝癌細胞生物學行為的影響及其分子機制. 首先建立AMACR穩(wěn)定過表達細胞株， 然后提取AMACR過表達細胞株的全蛋白， 進行無標記定量蛋白質(zhì)組學研究， 最后對鑒定結(jié)果進行生物信息學分析和結(jié)果驗證, 共篩選出138種差異表達蛋白. 這些差異表達蛋白主要參與代謝加工、 細胞加工等， 證明AMACR的過表達對于肝癌細胞的生物學行為影響巨大. IPA分析發(fā)現(xiàn)， 這些差異表達蛋白主要參與了ERK1/2信號通路和NF-κB信號通路. 以上結(jié)果說明, AMACR的過表達通過調(diào)節(jié)ERK1/2和NF-κB信號通路等手段改變肝癌細胞的生物學行為.

關(guān)鍵詞：肝細胞癌； α-甲?；o酶A消旋酶； 細胞增殖； 無標記定量蛋白質(zhì)組學

0引言

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma， HCC， 簡稱肝癌)是消化系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤之一， 其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢. 目前肝癌的治療仍以手術(shù)切除為首選， 局部化療、 介入治療、 射頻消融治療、 免疫治療甚至肝移植等多種方式被廣泛應(yīng)用， 但肝癌病人的遠期生存率仍不夠理想. 肝癌具有增殖速度快的特點， 以致于出現(xiàn)臨床癥狀并且被診斷時肝癌通常處于中晚期. 因此持續(xù)、 深入研究肝癌的發(fā)生、 發(fā)展是早日攻克肝癌這一頑疾的必經(jīng)之路.

α-甲酰基輔酶A消旋酶(AMACR)是一種由P504S基因編碼的包含382個氨基酸的胞漿蛋白, 存在于人類的線粒體和過氧化物酶體中， 在側(cè)鏈脂肪酸及脂肪酸衍生物的β氧化和膽酸代謝中間產(chǎn)物的氧化中發(fā)揮重要作用[1]. 在前列腺癌的研究中， AMACR作為重要的愈后診斷因子被廣泛接受. 除前列腺癌外， 在其他惡性腫瘤中AMACR同樣存在過表達現(xiàn)象， 如在胃腸道間質(zhì)瘤中， AMACR基因的表達量增加可增強細胞增殖， 增加腫瘤侵襲性[2]. 黃新輝等[3]發(fā)現(xiàn)AMACR同樣過表達于巨大肝癌的組織樣品中， 后續(xù)研究證實AMACR同樣可以作為肝癌的愈后指標. AMACR的過表達被證實與癌癥的發(fā)生、 發(fā)展有密切的關(guān)系， 例如AMACR的過表達促進粘液纖維肉瘤的增長. 當抑制AMACR在前列腺癌和粘液纖維肉瘤中的表達時， 發(fā)現(xiàn)癌細胞的增殖同樣受到了抑制， 同時， PI3K/AKT信號通路以及細胞凋亡和細胞周期(包括cyclin D1, cyclin T2)均受到了影響[4]. 綜上所述， AMACR的高表達對腫瘤的增殖具有積極的促進作用， 但這一結(jié)論在肝癌中尚未被證實.

蛋白質(zhì)組學作為后基因組時代的一個非常重要的領(lǐng)域， 在生物系統(tǒng)及疾病和醫(yī)療領(lǐng)域起到非常重要的作用. 研究和分析差異蛋白便于人們更好地理解疾病發(fā)病機制、 篩選生物靶標等. 無標記定量蛋白質(zhì)組學方法與標記定量蛋白質(zhì)組學方法相比具有樣品制備簡單、 成本低廉、 數(shù)據(jù)分析便捷等優(yōu)點， 同時無標記定量方法與基于標記的定量方法可達到相似的準確度[5]. 應(yīng)用無標記定量蛋白質(zhì)組學的方法比較分析AMACR過表達對細胞的改造作用， 在蛋白組水平上闡釋AMACR促進肝癌細胞生長、 增殖的分子機制.

1材料與方法

1.1材料及試劑

人肝癌細胞株HepG2購自ATCC； AMACR慢病毒表達載體由本實驗室人員構(gòu)建, 該載體在過表達AMACR的同時還表達有綠色熒光蛋白， 經(jīng)測序分析質(zhì)粒完全正確； AMACR抗體購自abcam公司； 質(zhì)譜儀為Thermo公司的LTQ系列； 蛋白提取液配方包含： 8 mol·L-1尿素， 50 mmol·L-1NH4HCO3， 50 mmol·L-1的碘乙酰胺和cocktail 蛋白酶抑制劑； 酶解液為含有100 ng·μL-1胰酶、 50 mmol·L-1NH4HCO3和50 g·L-1乙腈的水溶液.

1.2方法1.2.1慢病毒的包裝

接種1×107個293T細胞， 待細胞匯合度達70%～80%時(約24 h)， 更換為Opti-MEM培養(yǎng)基， 并使用Lipofectamine 3000進行轉(zhuǎn)染， 實驗步驟參照廠家說明書. 收集24 h和48 h的細胞上清液， 4 ℃、 2 000g離心10 min， 然后將上清液用0.45 μm的濾器過濾， 分裝并于-80 ℃保存.

1.2.2AMACR過表達肝癌細胞株構(gòu)建

接種 5×105個細胞， 培養(yǎng)24 h后， 利用AMACR過表達慢病毒(pAMACR)和空白對照慢病毒(按照病毒 ∶細胞=10 ∶1的比例)感染HepG2細胞. Polybrene(5 μg·mL-1) 作為感染增強劑， 在感染的同時加入. 24 h后更換培養(yǎng)基， 48 h后加入2 μg·mL-1的嘌呤霉素篩選， 此后以1 μg·mL-1的嘌呤霉素維持培養(yǎng).

1.2.3蛋白樣品的制備及酶解

細胞經(jīng)PBS沖洗3次后， 使用500 μL細胞裂解液抽提蛋白， 然后用細胞刮刀回收提取液， 超聲破碎細胞， 條件為： 超聲1 s， 停5 s， 共8 min. 離心取上清液. 往蛋白提取液中加入DTT至終濃度為8 mmol·L-1， 55 ℃加熱25 min， 室溫冷卻后加IAA至終濃度為50 mmol·L-1， 避光反應(yīng)30 min. BCA法測定蛋白濃度， 操作按照儀器公司說明書進行. 取30 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳， 檢測蛋白提取質(zhì)量.

將200 μg蛋白加入超濾管中， 離心至殘留體積為20 μL左右. 加入400 μL、 50 mmol·L-1NH4HCO3， 離心后棄濾液， 將濾膜放入新的EP管中， 加入酶解液， 37 ℃搖床過夜. 加入5%(體積分數(shù))的TFA終止消化， 再加100 μL、 50 mmol·L-1NH4HCO3離心至殘留體積約為20 μL. 將濾液混合均勻， 取5 μg至PCR管， 蒸干用于檢測樣品質(zhì)量. 其余濾液用低溫濃縮儀濃縮， 至體積小于100 μL時轉(zhuǎn)移至PCR管， 蒸干用于質(zhì)譜檢測.

1.2.4高pH值反相分離肽段

凍干的肽段樣品復溶于A緩沖液中(A緩沖液： 50 g·L-1乙腈， 0.1%甲酸(體積分數(shù))的水溶液， pH值用NH4HCO3調(diào)至10.0). 肽段的第一維分離使用的HPLC系統(tǒng)是Agilent 1260 Infinity system， 選用高pH值反向?qū)游鲋?Durashell C18, 5 μm, 4.6 mm×250 mm, Bonna-Agela Technologies)進行分離.

1.2.5低pH值 nano色譜分離及串聯(lián)質(zhì)譜分析

每一個組分的樣品， 首先經(jīng)filter過濾， 再在trap柱中富集除鹽后以300 nL·min-1的流速經(jīng)過Acclaim PepMap C18, 75 μm×15 cm 分析柱分離樣品. 洗脫肽段經(jīng)由納升級電噴霧離子源接口噴出， 進入LTQ Orbitrap Velos高分辨率質(zhì)譜儀進行檢測分析. 每組樣品應(yīng)用2D-LC MS/MS檢測3次.

1.2.6蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的搜索

使用MaxQuant(Version 1.4.1.2)搜索引擎對MS/MS肽段進行數(shù)據(jù)庫搜索， 搜庫結(jié)果采用Target-decoy策略進行過濾， 并設(shè)定肽段和蛋白質(zhì)鑒定FDR≥99%.

1.2.7qRT-PCR方法二次驗證AMACR的過表達和蛋白質(zhì)組定量結(jié)果

收集對數(shù)生長期的細胞， 采用Trizol法提取細胞總RNA并定量， 取1 μg的 RNA進行反轉(zhuǎn)錄， 然后通過qPCR 分析AMACR 在mRNA水平的表達. 實驗使用的引物包括： AMACR上游引物為5’-ATTTGGCTTTGTCAGTGTTCT-3’， 下游引物為5’-GCGGTCAAAAAGAGCCATTAT-3’；β-actin上游引物5’-CCACTGGCATCGTGATGGAC-3’， 下游引物5’-GCGGATGTCCACGTCACA -CT-3’； FABP5上游引物5’-ATGAAGGAGCTAGGAGTGGGA-3’， 下游引物 5’-TGCACCATCTGTAAA GTTGCAG-3’. PCR擴增條件： 94 ℃， 5 min. 然后進行40個循環(huán)的基因擴增， 條件為： 95 ℃， 15 s； 60 ℃， 31 s； 72 ℃， 31 s. 每次實驗包含2個技術(shù)重復， 并且每個基因獨立檢測3次， 所得qRT-PCR結(jié)果使用2-ΔΔCT進行計算.

1.2.8Western blot驗證AMACR的過表達

AMACR過表達的細胞樣品經(jīng)RIPA試劑裂解后， 回收上清液作為粗提蛋白， 經(jīng)BCA定量后取50 μg進行SDS-PAGE電泳； 轉(zhuǎn)膜， 封閉后， 孵育AMACR抗體(1/600稀釋的)或GAPDH抗體(1/2 000)， 4 ℃過夜； 再使用TBST洗滌3次后， 孵育HRP標記的二抗(1/5 000稀釋)， 室溫反應(yīng)1 h； 再次洗膜后， 進行ECL化學發(fā)光檢測.

1.2.9質(zhì)譜鑒定蛋白的生物信息學分析

應(yīng)用GO數(shù)據(jù)庫對鑒定出的差異表達蛋白質(zhì)進行細胞成分和生物學加工分析. 差異蛋白間的相互作用網(wǎng)絡(luò)通過Ingenuity Pathway Analysis(IPA)數(shù)據(jù)庫進行分析.

1.2.10統(tǒng)計學處理

通過 t檢驗， 將蛋白表達差異大于2倍或小于0.5倍， 同時P<0.05的蛋白定義為顯著差異蛋白.

2結(jié)果

2.1穩(wěn)定過表達AMACR肝癌細胞株的建立

慢病毒轉(zhuǎn)染HepG2細胞后經(jīng)嘌呤霉素篩選熒光顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)良好， 說明慢病毒轉(zhuǎn)染對細胞沒有明顯毒性作用； 綠色熒光和明場重合度極高， 證明細胞轉(zhuǎn)染效率達90%以上(見圖1(a)). 同時， Western blot結(jié)果顯示AMACR的表達量在過表達組中比參照組中高8.36倍(見圖1(b)、 (c)).

2.2蛋白樣品濃度測定和樣品質(zhì)量檢測

在562 nm波長下讀取蛋白標準品和樣品的吸光值， 繪制出標準曲線， 得到直線回歸方程y=1.495x+0.14 (R2=0.996 7). 計算得出AMACR過表達組和參照組的蛋白質(zhì)量濃度分別是1.623和2.294 μg·μL-1. 取50 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳, 結(jié)果顯示， 2組樣品之間平行度較好， 蛋白的相對分子質(zhì)量主要富集在25～100 ku區(qū)域， 蛋白條帶清晰， 初步表明蛋白提取效果理想， 樣品適合進行蛋白質(zhì)組研究.

2.3蛋白鑒定及差異蛋白的篩選

經(jīng)無標定量質(zhì)譜分析， 共鑒定到1 886種蛋白滿足我們設(shè)定的標準(FDR≥99%). 如圖2(a)所示， 這些蛋白的相對分子質(zhì)量分布于1～200 ku內(nèi)， 主要集中于30～50 ku范圍， 與文獻[6]報道相似， 證明質(zhì)譜鑒定結(jié)果準確、 可靠. 另外， 將特異性表達在AMACR過表達細胞或參照細胞上的蛋白以及表達差異大于2倍或小于0.5倍(p<0.05)的蛋白定義為差異蛋白. 根據(jù)該設(shè)置， 共篩選出138種差異蛋白(見圖2(b))， 包括124種上調(diào)蛋白， 14種下調(diào)蛋白， 其中105種蛋白在AMACR過表達組和參照組中均有表達， 另外有28種蛋白只在AMACR過表達的細胞中特異性地出現(xiàn)， 有5種蛋白在AMACR過表達的細胞株中特異性地消失. 這些特異性存在和特異性缺失的蛋白充分體現(xiàn)了AMACR對于細胞的改造作用.

2.4差異蛋白的生物信息學分析

利用GO對差異蛋白的亞定位分析發(fā)現(xiàn)， 差異蛋白主要存在于細胞器、 大分子復合物中(見圖3(a)). 由于AMACR主要存在于溶酶體和線粒體中， 它表達量的變化對與之作用的蛋白會產(chǎn)生直接影響， 因此差異蛋白亞定位結(jié)果是合理的. 通過生物學加工分析發(fā)現(xiàn)， 這些差異蛋白所參與的生物加工主要是細胞加工、 代謝加工、 生物調(diào)節(jié)等過程(見圖3(b)). 這說明由于AMACR的過表達直接改變了HepG2細胞的正常代謝， 對細胞生物學性狀的改變明顯.

應(yīng)用IPA軟件對差異蛋白所涉及的信號通路以及相互作用網(wǎng)絡(luò)進行分析. 圖3(c)、 (d)是IPA分析中得分最高的兩個蛋白網(wǎng)絡(luò)圖. 兩個網(wǎng)絡(luò)分別聚集了30種和24種差異蛋白. 如圖3(c)所示， 線粒體復合物作為該蛋白網(wǎng)絡(luò)的一個節(jié)點與7種差異蛋白相連， 這一結(jié)果與AMACR的定位一致. 同時， IPA的結(jié)果提示這些差異蛋白間的相互調(diào)節(jié)主要由ERK1/2和NF-κB兩條信號通路相連. ERK1/2信號途徑是一個重要的癌細胞的增殖、 生長和凋亡的調(diào)節(jié)子[7]. NF-κB是一個重要的轉(zhuǎn)錄因子， 對于癌細胞的存活、 增殖、 抗凋亡均有調(diào)節(jié)作用[8-9].

2.5差異蛋白質(zhì)的熒光定量PCR驗證

如圖4(a)所示， AMACR的mRNA表達水平在過表達細胞中比參照細胞中高約200倍， 再次證明建立的AMACR過表達細胞系成功. 另外以FABP5基因為例， 對質(zhì)譜鑒定結(jié)果進行驗證， 結(jié)果證明AMACR過表達組中FABP5的mRNA表達量較參照組高3倍， 該結(jié)果與質(zhì)譜結(jié)果一致(見圖4(b))， 證明質(zhì)譜鑒定結(jié)果正確、 可信(結(jié)果均具有統(tǒng)計學意義，P<0.05).

3討論

之前的實驗室研究發(fā)現(xiàn)， AMACR是一種新的肝癌標志物[3, 10-11]. 在其它類型癌癥中， AMACR不僅是一種腫瘤標志物， 更是一種腫瘤惡化的促進因子[12]， 而AMACR的促癌功能在肝細胞癌中仍沒有被驗證. AMACR是一種存在于溶酶體、 線粒體中的支鏈脂肪酸氧化酶， 它的過表達可以加快支鏈脂肪酸的β氧化， 而脂肪酸β-氧化過程可以生成乙酰CoA， 后者是一種十分重要的中間化合物， 既可以進入三羧酸循環(huán)為細胞提供能量， 還可以為許多重要化合物合成提供原料， 如酮體、 膽固醇和類固醇化合物. 因此， AMACR的過表達一方面可以為細胞提供過剩的能量， 另一方面可以為細胞的代謝提供過剩的原料， 進而加快細胞的代謝. 因此從生化的角度分析， AMACR的過表達存在促進細胞生長、 增殖的潛力.

另外， GO分析發(fā)現(xiàn)， AMACR的過表達導致58.3%的差異蛋白參與了代謝加工和細胞加工的過程， 這說明AMACR的過表達必然引起細胞的生物學行為發(fā)生改變. 而IPA分析發(fā)現(xiàn)， 由于AMACR過表達引起的差異表達蛋白主要涉及ERK1/2信號途徑和NF-κB信號途徑. 如前文所述， 這兩個信號途徑在癌細胞的生長、 增殖、 凋亡過程中發(fā)揮著重要的作用. 它們可能是AMACR促進肝癌細胞生長、 增殖所依賴的最重要的分子機制.

結(jié)合之前的文獻報道， 共找到5種與癌細胞增殖相關(guān)的蛋白(見表1)， 包括： U2AF2、 FABP5、 SDC1、 ADGB和C1QBP. 以表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid binding protein5, FABP5)基因為例. 據(jù)報道沉默F(xiàn)ABP5 基因能夠抑制肝癌細胞的增殖, 將細胞周期阻滯于G2/M期, 使肝癌細胞凋亡顯著增加. JEONG等[13]報道在肝內(nèi)膽管癌中FABP5的表達量與癌癥分期顯著正相關(guān)， 并且當FABP5被過表達后， 癌細胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增加、 細胞的增殖侵襲能力增強. 在本課題研究中， FABP5被AMACR顯著上調(diào)， 而且FABP5同樣涉及脂肪酸的代謝， 因此猜測FABP5與AMACR可能存在某種相互作用， 進而協(xié)同地調(diào)節(jié)癌細胞的增殖. 再如補體1Q結(jié)合蛋白(C1QBP)存在于線粒體的基質(zhì)中. 據(jù)報道該蛋白在其它類型的癌癥中顯著上調(diào)， 而當C1QBP被缺失后， 細胞的增殖減弱， 凋亡增多. 結(jié)合IPA結(jié)果(見圖4(c))發(fā)現(xiàn)， C1QBP與線粒體復合物發(fā)生直接的相互作用， 因此推測AMACR的過表達增加了C1QBP的表達量， 后者進一步促進了癌細胞的增殖. 除此之外， 還發(fā)現(xiàn)由于AMACR的過表達， 造成BCL-2樣蛋白1(B2LCL1)的表達量顯著升高， 該蛋白是一個已經(jīng)被證實的、 重要的細胞凋亡抑制蛋白. 這說明AMACR的過表達將通過調(diào)節(jié)BCL-2的表達實現(xiàn)對肝癌細胞凋亡的抑制.

表1　細胞增殖相關(guān)的差異表達蛋白

注： ↓代表蛋白在AMACR過表達組與空載組中表達量比值下降, ↑代表蛋白在AMACR過表達組與空載組中表達量比值升高

綜上所述， AMACR的過表達一方面為肝癌細胞的生長、 增殖提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)， 另一方面， 依賴ERK1/2和NF-κb信號通路并且上調(diào)多種促癌因子增強腫瘤生長、 增殖和抗凋亡的能力.

4結(jié)論

研究采用無標記定量蛋白質(zhì)組學對AMACR過表達細胞與正常細胞進行比較分析， 共篩選出138種表達差異在2倍以上的差異蛋白， 其中有58%的差異蛋白涉及代謝加工和細胞加工， 證明AMCR的過表達對于肝癌細胞的生物學行為影響巨大. IPA分析發(fā)現(xiàn)， 這些差異蛋白主要涉及ERK1/2信號通路和NF-κB信號通路. 結(jié)合文獻報到共找到6種促癌細胞增殖蛋白.

綜合以上結(jié)果證明, AMACR的過表達通過調(diào)節(jié)ERK1/2和NF-κB信號通路以及上調(diào)多個促癌因子的表達量等手段改變肝癌細胞的生物學行為， 并具有促進肝癌細胞的生長和增殖的潛力， 為進一步研究AMACR的分子功能提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ).

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(責任編輯： 洪江星)

Label-free quantitative proteomic analysis of the effect of AMACR overexpression on biological behaviors of hepatocellular carcinoma cells

XIA Jiangbao1, 2, XING Xiaohua2, WANG Yingchao2, SHEN Zuojun3

(1. Department of Medicine Laboratory of Bengbu Medical College, Bengbu, Anhui 233030, China；2. The United Innovation of Mengchao Hepatobiliary Technology Key Laboratory of Fujian Province,Mengchao Hepatobiliary Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou, Fujian 350025, China；3. Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University, Anhui Provincial Center for Clinical Laboratories，Hefei, Anhui 230001, China)

Abstract:This study attempted to investigate the effect of AMACR overexpression on the biological behavior of HCC cells using label free quantitative proteomic approch. A stable cell line that overexpressed AMACR was produced by transducing engineered lentivirus containing AMACR complete sequence into HepG2 cells. Afterwards, the whole protein extracted from the AMACR-overexpressed cells and the normal cultured cells (control) were comparatively quantified by 2D LC-MS/MS. A total of 138 differentially expressed proteins were identified. These dysregulated proteins were mostly enriched for metabolic process and cellular process, which suggested a big change at biological behaviors occurred in the host cells due to AMACR overexpression. The signalings pathway analysis revealed that the dysregulated proteins in AMACR-overexpressed cells are more concentrated to the ERK1/2 and NF-κB signaling pathways. Thus, AMACR overexpression induced the alterations at biological behaviors of HCC cells majorly through modulating the ERK1/2 and NF-κB signalings.

Keywords:hepatocellular carcinoma; AMACR; cell proliferation; label-free quantitative proteomics

中圖分類號：R735.7

文獻標識碼：A

基金項目：福建省自然科學基金資助項目(2015J05174)； 福建省衛(wèi)生計生委青年科研課題資助項目(2015-1-94)； 福州市科技強院建設(shè)項目(編號：2014-S-139-3)； 福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院科研資助項目(QDZJ-2014-005)； 福建中醫(yī)藥大學校管科研課題資助項目(XB2014096)

通訊作者:王英超(1983-)， 博士， 助理研究員， 主要從事腫瘤蛋白質(zhì)組學研究， yingchaowang@live.com

收稿日期:2015-11-30

文章編號：1000-2243(2016)02-0282-07

DOI:10.7631/issn.1000-2243.2016.02.0282

沈佐君(1963-)， 博士， 副教授， 主任檢驗師， 主要從事腫瘤的早期診斷和預(yù)后判斷， shenzuojun@163.com