嚴軍雄,伍偉健,周健欣,盧　瑾

(1.佛山市第四人民醫(yī)院，廣東佛山 528000；2.佛山市中心血站，廣東佛山 528000)

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·論著·

佛山地區(qū)無償獻血人群人細小病毒B19感染情況分析*

嚴軍雄1,伍偉健2△,周健欣2,盧瑾2

(1.佛山市第四人民醫(yī)院，廣東佛山 528000；2.佛山市中心血站，廣東佛山 528000)

摘要:目的了解佛山地區(qū)無償獻血人群人細小病毒(HPV)B19 感染現(xiàn)狀。方法采用ELISA檢測血液中的HPV B19 IgG和IgM抗體，并用PCR檢測抗體陽性標本HPV B19 DNA。結(jié)果368例無償獻血者標本中檢出HPV B19 IgG陽性92例，陽性率為25.00%；檢出HPV B19 IgM陽性2例，陽性率為0.54%，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。94例抗體陽性標本中，檢測HPV B19 DNA 陽性4例，陽性率為4.26%。結(jié)論佛山地區(qū)無償獻血人群存在較高的HPV B19既往感染率，急、慢性感染率較低，慢性感染者HPV B19病毒載量較低。

關鍵詞:無償獻血者；人類細小病毒B19；血清學檢測；實時熒光定量PCR

人細小病毒B19(HPV B19)是直徑為20～30 nm無囊膜包裹，3 500堿基組成的單鏈DNA病毒，屬細小病毒科嗜紅細胞病毒屬[1]。1975年在獻血者的血清中首次被發(fā)現(xiàn)，目前研究已經(jīng)證實HPV B19可引起人類多種疾病[2]，有經(jīng)血液傳播的風險[3]，由于我國未將HPV B19納入獻血者血液檢測項目中，故目前未見佛山市無償獻血人群HPV B19感染相關研究數(shù)據(jù)。為調(diào)查當前采血模式下佛山地區(qū)無償獻血人群HPV B19感染現(xiàn)狀和病毒載量，筆者對無償獻血人群采用ELISA檢測HPV B19抗體，采用PCR檢測DNA水平，獲得了本市無償獻血人群HPV B19感染相關研究數(shù)據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1血液標本隨機選取非團體無償獻血者368例，其中男208例、女160例，年齡18～57歲，抽取靜脈血液10 mL，分別置于2支一次性試管(EDTA抗凝，其中1支為核酸檢測專用管)各5 mL，離心取血漿待檢。

1.2試劑與儀器主要儀器包括酶免全自動前處理器(STAR3-2931型，瑞士HAMILTON公司)、全自動酶標儀(Anthos240rt型，奧地利Anthos公司)，實時熒光PCR儀(Bio-Rad CFX96型，美國Bio-Rad公司)。ELISA檢測試劑：HPV B19 IgG和IgM抗體試劑盒(美國WKSUBIO公司產(chǎn)品)。PCR試劑盒(上海之江生物科技股份有限公司產(chǎn)品)，PCR特異性引物與探針：上游引物5′-GGC ATG GTT AAC TGG AAT AA-3′，下游引物5′-TGC AGC ACT GTC AAC AGC ACT-3′，Taqman熒光探針。

1.3方法

1.3.1獻血者的篩選嚴格按照《獻血者健康檢查要求》《血站技術操作規(guī)程(2012版)》和市中心血站質(zhì)量標準、標準操作規(guī)程篩選獻血者，采集低危獻血者血液。

1.3.2HPV B19 IgG和IgM抗體檢測采用ELISA分別檢測HPV B19 IgG和IgM，嚴格按試劑說明書進行，檢測標本A值(S)/CO<1為陰性，S/CO≥1為陽性。

1.3.3HPV B19 DNA檢測抗體陽性標本采用Real time RT-PCR檢測HPV B19 DNA。標本和對照品核酸裂解處理：標本50 μL分別加入50 μL核酸提取液，震蕩混勻10 s，99 ℃水浴10 min，13 000 r/min離心10 min，保留上清液備用，H2O為陰性對照，陽性對照品作10倍、100倍、1 000倍梯度稀釋。試劑配制：取HPV B19 核酸熒光PCR檢測混合液與1 μL內(nèi)部對照品，加入0.4 μL酶(Taq+UNG)震蕩混勻10 s，3 000 r/min離心10 s。加樣：取混合液36 μL置于PCR管中，加入樣品處理上清液、H2O和陽性對照品各4 μL分別加入PCR管。反應程序：37 ℃，2 min；94 ℃，2 min；40個循環(huán)：93 ℃，15 s，58 ℃，30 s，60 ℃，30 s。單點熒光檢測在60 ℃，制備溶解曲線：65 ℃，5 s；0.5 ℃/s上升溫至95 ℃。熒光通道檢測選擇：FAM和HEX(或VIC/JOE)通道。

1.4統(tǒng)計學處理采用多個樣本率比較的χ2檢驗和四格表χ2檢驗(當n≥40，理論頻數(shù)1≤T<5時，對χ2值進行連續(xù)性校正；當n≥40，理論頻數(shù)T<1時，采用四格表的Fisher確切檢驗法)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1抗體檢測結(jié)果如表1所示，368例無償獻血者標本中檢出HPV B19 IgG陽性92例，陽性率為25.00%；檢出HPV B19 IgM陽性2例，陽性率為0.54%，男女性別間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);IgG與IgM陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。如表2所示，按年齡分組，兩組間IgG陽性率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，IgM陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1　　不同性別HPV B19 IgG和IgM的檢測結(jié)果

表2　　不同年齡人群間HPV B19 IgG和IgM的檢測結(jié)果

2.2DNA檢測94例抗體陽性標本中，檢測HPV B19 DNA 陽性4例，陽性率為4.26%，經(jīng)四格表的Fisher確切檢驗，按組間抗體陽性比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表3。

表3　　94例HPV B19 IgG和IgM陽性標本HPV B19

-:該項無數(shù)據(jù)。

3討論

HPV B19是唯一致人感染的細小病毒，多表現(xiàn)為隱性感染，可引起小兒免疫型血小板減少癥(ITP)、兒童傳染性紅斑，孕婦貧血、流產(chǎn)、死胎，成人關節(jié)炎或關節(jié)病、貧血、肝炎、再生障礙性貧血危象等嚴重疾病[4-6]。HPV B19是一種容易變異的病毒，對熱穩(wěn)定，56 ℃ 30 min仍可存活，對甲醛敏感，對常規(guī)血漿滅活方法不敏感[6]。國內(nèi)血液制品生產(chǎn)工藝中使用了滅活/去除HPV B19的方法，但有研究中篩查的原料血漿及血液制品中仍檢出了HPV B19 DNA[7]。國內(nèi)多地開展了HPV B19檢測的研究性實驗。王志效等[8]檢測濟寧地區(qū)無償獻血者HPV B19 IgG抗體、IgM抗體陽性率分別為36.15%、5.94%，抗體陽性標本DNA 陽性率為0.83%。鮑海娥等[9]檢測三峽地區(qū)獻血員HPV B19 IgG陽性率43.36%，HPV B19 IgM陽性率2.46%。劉運保等[10]檢測376例廣東瑤族獻血者血液，HPV B19 IgG陽性率為29.26%，42例HPV B19 IgG陽性血液中HPV B19 DNA陽性率為9.52%。檢測結(jié)果顯示，不同地區(qū)獻血人群均存在著HPV B19感染。

遏制經(jīng)輸血傳播疾病是血液安全的重要任務。歐洲藥品管理局(EMA) 2011年發(fā)布的《血漿衍生制品指南》要求病毒滅活血漿和抗-D免疫球蛋白需進行B19核酸檢測[11]，歐洲藥典要求病毒滅活血漿B19水平應小于104IU/mL[11]。但除了我國《血站技術操作規(guī)程(2012版)》規(guī)定必檢的項目(HBV表面抗原或DNA、HCV抗體或RNA、HIV抗體或RNA、梅毒抗體)外，HPV B19等多種經(jīng)血傳播疾病未經(jīng)檢測，對血液制品的安全構(gòu)成了一定的威脅，直接影響用血者的健康。目前，本市采供血機構(gòu)已經(jīng)建立了完善的血液質(zhì)量管理體系，采血前對獻血者進行詳細的健康征詢，對有流感樣、紅斑、急性關節(jié)炎、貧血、肝炎等癥狀者嚴格篩選，堅持從低危獻血者中采集血液。本市HPV B19 IgG陽性率遠高于IgM，IgG陽性率組間年齡結(jié)果比較，高齡組高于低齡組，顯示既往感染率較高，急、慢性感染率均較低，慢性感染率與年齡呈正相關。IgM 抗體陽性組DNA 檢出率明顯高于IgG 陽性組，與王志效等[8]報道相一致。IgM可用于HPV B19感染的急性期檢測，本試驗HPV B19 IgM陽性2例病毒載量均大于1×106copy/mL，提示有較強的傳染性；IgG陽性率略低于省內(nèi)其他地區(qū)，HPV NDA檢測陽性2例，病毒載量低于IgM陽性標本病毒載量。若高HPV B19病毒載量的血液輸給患者，可能會造成患者感染。

目前臨床用血量不斷上升，血液供求關系緊張，如果全部獻血者血液均進行HPV B19 IgG篩查，則血液的陽性率大大攀升，大量安全的血液將被報廢浪費，而且Kleinman等[12]研究數(shù)據(jù)表明含B19特異性抗體的成分血在HPV B19 DNA<106IU/mL 時不會導致感染HPV B19。凌輝生等[13]初步建立了HPV B19 IgM抗體間接ELISA檢測方法。建立HPV B19 IgM加HPV B19 DNA的血液篩查模式，則更有利于遏制HPV B19通過輸血傳播，需要解決的問題是降低HPV B19相關檢測試劑盒的費用，提高試劑特異性和和減少假陽性率。同時，采供血機構(gòu)應建立HPV B19 IgM抗體陰性和病毒核酸檢測陰性的資料庫，使孕婦、嬰幼兒、免疫力低下者、再生障礙性貧血危象等患者得到更加安全、有效的血液。

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Human parvovirus B19 detection in voluntary blood donors of Foshan City*

YanJunxiong1,WuWeijiang2△,ZhouJiangxin2,LuJin2

(1.TheFourthPeople′sHospitalofFoshan,Foshan,Guangdong528000,China;2.FoshanBloodCenter,Foshan，Guangdong528000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the infection status of human parvovirus B19(HPV B19) in voluntary blood donors of Foshan City.MethodsThe HPV B19 IgG and IgM antibodies of voluntary blood donors were detectd by using ELISA.Real-time PCR assay was applied to detect HPV B19 DNA on HPV B19 IgG and/or IgM antibody positive specimens.ResultsThere were 92 HPV B19 IgG positive cases in 368 specimens,positive rate was 25.00%;and the HPV B19 IgM positive cases were 2,positive rate was 0.54%.4 positive cases were detected in 94 antibody positive specimens,positive rate was 4.26%.ConclusionHPV B19 infection of blood donation person in Foshan is high,new infections and chronic infection rate are low.HPV B19 viral loads are low in people with chronic infection.

Key words:blood donors;human parvovirus B19；serological determination；real time PCR

(收稿日期：2016-01-05)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.08.010

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)08-1039-03

基金項目：廣東省佛山市衛(wèi)生和計劃生育局科技項目(2014160)。

作者簡介：嚴軍雄，男，主管檢驗技師，主要從事血液檢測和輸血技術研究。△通訊作者，E-mail：wwjzqcn1@163.com。