郭曉潔　毛善平　董慧敏　劉寶輝　臘瓊　王舜　方聰聰

430060　武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科[郭曉潔　毛善平(通信作者)　董慧敏　臘瓊　王舜　方聰聰]，神經(jīng)外科[劉寶輝]

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·論著·

缺血后處理對(duì)PC12細(xì)胞缺血再灌注損傷致細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制研究

郭曉潔毛善平董慧敏劉寶輝臘瓊王舜方聰聰

430060武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科[郭曉潔毛善平(通信作者)董慧敏臘瓊王舜方聰聰]，神經(jīng)外科[劉寶輝]

【摘要】目的探討缺血后處理對(duì)PC12細(xì)胞缺血再灌注損傷引起的細(xì)胞凋亡的作用及其作用機(jī)制。方法將PC12細(xì)胞分為3組：正常組、缺血再灌注組、缺血后處理組。缺血再灌注組予以糖氧剝奪12 h后正常培養(yǎng)，缺血后處理組經(jīng)糖氧剝奪12 h后予以3個(gè)循環(huán)的正常培養(yǎng)(10 min)→糖氧剝奪(10 min),再正常培養(yǎng)12 h后通過Hoechst染色檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況，應(yīng)用Westernblot 檢測(cè)各組細(xì)胞Caspase-3活化蛋白及磷酸化NF-κB/p65蛋白表達(dá)水平，采用RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞NF-κB及Caspase-3 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果Hoechst染色顯示缺血后處理可降低缺血再灌注引起的細(xì)胞凋亡；與對(duì)照組相比, 缺血再灌注組磷酸化NF-κB/p65和Cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)水平高；缺血后處理組磷酸化NF-κB/p65和Cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)水平明顯低于缺血再灌注組；NF-κB和Caspase-3的mRNA表達(dá)趨勢(shì)與蛋白表達(dá)基本一致。結(jié)論缺血后處理可以減輕缺血再灌注損傷引起的PC12細(xì)胞凋亡，這可能與NF-κB/p65信號(hào)通路有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】缺血后處理PC12細(xì)胞NF-κB/p65凋亡

【DOI】10.3969/j.issn.1007-0478.2016.02.001

缺血性腦卒中是一種嚴(yán)重的急性腦血管疾病，它的發(fā)病特點(diǎn)是大腦血液流動(dòng)的中斷導(dǎo)致快速的神經(jīng)損傷[1]。缺血性腦卒中治療的目的是使閉塞的腦血管再通，恢復(fù)缺血組織的血液供應(yīng)，減少梗死灶體積，而再灌注過程往往加重組織細(xì)胞功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞，這種損傷稱為再灌注損傷[2]，因此尋找有效的方法減輕缺血再灌注引起的損傷是急需解決的問題。缺血后處理是指在缺血發(fā)生后長時(shí)間的再灌注之前對(duì)臟器進(jìn)行數(shù)次短暫的再灌注/缺血循環(huán)處理的方法[3-4]。已證實(shí)缺血后處理可以減輕缺血再灌注損傷，是一種有效的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制。目前國際上關(guān)于缺血后處理在腦缺血再灌注中的作用的研究主要側(cè)重于抑制炎癥反應(yīng)和自由基生成，對(duì)細(xì)胞凋亡的作用及相關(guān)機(jī)制的報(bào)道相對(duì)較少。本研究利用 PC12 細(xì)胞建立腦缺血模型，觀察細(xì)胞凋亡情況及凋亡蛋白 Caspase-3 活化蛋白的表達(dá)水平，初步探討其作用機(jī)制，為進(jìn)一步深入研究其在缺血性腦血管疾病中的作用提供方向。

1材料與方法

1.1材料及主要儀器

PC12細(xì)胞(褐家鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞) 購于武漢大學(xué)生物典藏中心；RPMI-1640培養(yǎng)基、馬血清購于Gibco公司；胎牛血清購于杭州四季青公司，RIPA 裂解液(強(qiáng))試劑、BCA蛋白水平測(cè)定試劑盒、Hoechst 33342試劑均購于碧云天生物技術(shù)研究所；Trizol(Invitrogen),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo)，PCRmix(天根)，瓊脂糖(Agarose)；一抗phosphory-NF-κB/p65、Cleaved caspase-3、GAPDH購自Cell signaling Technology公司；熒光二抗來自美國LICOR公司，NF-κB、Caspase-3及GAPDH引物由上海生物工程公司合成，PVDF膜(Millipore)。三氣培養(yǎng)箱(長沙華曦電子科技有限公司)，酶標(biāo)儀(Perkin Elmer)，凝膠成像系統(tǒng)(Perkin Elmer)，紫外分光光度計(jì)(上海精科)，正置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯)，奧德賽紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(Licor Biosciences)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞用1640培養(yǎng)基(10%馬血清、5%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 mg/ml鏈霉素，2 mmol/L谷氨酰胺)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每2 d換液1次，3～4 d傳代1次，傳代時(shí)用0.25%胰酶室溫消化1 min，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞模型的構(gòu)建

將對(duì)數(shù)生長期的PC12細(xì)胞以1.5×105/孔接種于直徑為35 mm的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后棄培養(yǎng)基，PBS洗2次，分為3組：正常組、缺血再灌注組、缺血后處理組(圖 1)。正常組予以正常培養(yǎng)基于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，缺血再灌注組和缺血后處理組于37℃、0.5% O2、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行糖氧剝奪12 h，依據(jù)Pignataro等[3]的方法并加以改進(jìn)，缺血后處理組細(xì)胞經(jīng)糖氧剝奪12 h后予以3個(gè)循環(huán)正常培養(yǎng)10 min/糖氧剝奪10 min，再予以正常培養(yǎng)12 h，分別用Hoechst染色于正置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的凋亡情況、Western blot法檢測(cè)Caspase-3 活化蛋白和NF-κB/p65蛋白表達(dá)水平、RT-PCR檢測(cè)Caspase-3和NF-κB的mRNA表達(dá)水平。

圖1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組情況

1.2.3Hoechst染色觀察細(xì)胞凋亡情況取對(duì)數(shù)生長期的PC12細(xì)胞以1.5×105/孔接種于直徑為35 mm的培養(yǎng)皿中的潔凈蓋玻片上，待細(xì)胞貼壁后棄培養(yǎng)基處理細(xì)胞；細(xì)胞經(jīng)缺血處理后棄培養(yǎng)液加入0.5 mL固定液，室溫固定10 min，然后棄固定液，PBS洗2次，每次5 min，吸盡液體后加入0.5 mL Hoechst 33342染色液，完全覆蓋細(xì)胞，室溫放置10 min，吸盡Hoechst染色液，PBS洗2次，每次5 min，隨后滴1滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，在正置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的凋亡情況。

1.2.4Western blot法測(cè)定Cleaved caspase-3及p-p65的蛋白表達(dá)水平

各組PC12細(xì)胞處理后棄培養(yǎng)基，預(yù)冷的PBS洗3次，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min左右，用干凈的刮棒收集細(xì)胞于1.5 mLEP管中，4 ℃ 12000 r/min離心5 min，收集上清液，BCA法測(cè)蛋白水平。取50 ug蛋白以12% SDS-PAGE電泳分離，聚偏二氟乙烯膜(PVDF)轉(zhuǎn)膜，使用TBS清洗PVDF膜后室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h，TBS清洗后置膜于稀釋的兔抗鼠一抗中(p-NF-κB/p65，1:1000；Cleaved caspase-3，1:1000；GAPDH，1:1000)，4 ℃ 孵育過夜，TBST洗膜后置膜于羊抗兔熒光二抗(1：15000)室溫孵育2 h，PBST洗膜3次，每遍5 min，Odyssey Infrared Imaging System掃膜。

1.2.5RT-PCR檢測(cè)NF-κB及Caspase-3的mRNA表達(dá)水平

TRIZOL法提取各組細(xì)胞總RNA，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)量各組RNA純度及水平，兩步法RT-PCR反應(yīng)(參照Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及天根PCRmix說明書)，取2 μg總 RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增目的基因(PCR反應(yīng)參數(shù): 94 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán))；1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離基因片段(100 V，30 min)，用凝膠成像系統(tǒng)分析PCR產(chǎn)物電泳條帶密度值。引物序列如下，NF-κB：上游引物5'-TTCCCTGAAGTGGAGCTAGGA-3'，下游引物5'-CATGTCGAGGAAGACACTGGA-3'；Caspase-3：上游引物5'-GGACCTGTGGACCTGAAAAA-3'，下游引物5'-GCATGCCATATCATCGTCAG-3'；GAPDH：上游引物5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'，下游引物5'-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1缺血后處理可以減輕缺血再灌注引起的PC12細(xì)胞凋亡

如圖2所示，PC12細(xì)胞經(jīng)Hoechst染色后在正置熒光顯微鏡下觀察可見，正常組細(xì)胞胞核呈淡藍(lán)色，缺血再灌注組較多的細(xì)胞胞核致密濃染呈亮藍(lán)色或呈碎塊狀致密濃染；缺血后處理組致密濃染的細(xì)胞核較缺血再灌注組明顯減少。與正常組相比，缺血再灌注組PC12細(xì)胞Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平增加(P<0.01)；缺血后處理組Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平與缺血再灌注組比較，明顯減少(P<0.01)(圖 3) 。

圖2 熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞Hoechst染色情況

圖3 WesternBlot檢測(cè)各組細(xì)胞Cleavedcaspase-3的蛋白表達(dá)水平 缺血再灌注組與正常組比較,*P<0.01;缺血后處理組與缺血再灌注組比較,#P<0.01。

2.2各組磷酸化NF-κB/p65蛋白表達(dá)水平

缺血再灌注組PC12細(xì)胞p-p65蛋白表達(dá)水平較正常組增加(P<0.01)；與缺血再灌注組相比，缺血后處理組p-p65蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)(圖 4)。

2.3各組NF-κB及Caspase-3 mRNA表達(dá)水平

與正常組相比，缺血再灌注組PC12細(xì)胞NF-κB及Caspase-3的mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)；而缺血后處理組NF-κB及Caspase-3的mRNA表達(dá)水平明顯低于缺血再灌注組(P<0.05) (圖 5)。

3討論

缺血性腦卒中是一種全球范圍內(nèi)常見的、危及生命的腦血管疾病，其發(fā)病率和病死率較高。血栓或栓塞造成血管突然閉塞引起的缺血性腦卒中占所有腦卒中事件的87%[4-5]。因此，快速的再灌注治療對(duì)突發(fā)的腦缺血事件是至關(guān)重要的。但血管再通后的再灌注損傷是我們不可回避的一個(gè)問題。缺血后處理能夠減輕缺血再灌注損傷。與缺血預(yù)處理相比，缺血后處理應(yīng)用于持續(xù)的缺血性事件后可控性強(qiáng)，具有更大的臨床應(yīng)用前景[6]。目前研究者多采用動(dòng)物或體外實(shí)驗(yàn)來模擬缺血后處理的發(fā)生，但體內(nèi)研究受多種條件的限制，結(jié)果也容易受到干擾。體外培養(yǎng)神經(jīng)元可以使實(shí)驗(yàn)結(jié)果免受很多因素的干擾，可信度高，但原代培養(yǎng)成功率低，神經(jīng)元自然老化等原因無法保證持續(xù)傳代。PC12細(xì)胞來源于大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤，具有類似神經(jīng)元的形態(tài)和生理生化特性，可以持續(xù)穩(wěn)定傳代，作為一種工具細(xì)胞廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體外研究。

圖4 WesternBlot檢測(cè)各組細(xì)胞p-p65的蛋白表達(dá)水平 缺血再灌注組與正常組比較,*P<0.01;缺血后處理組與缺血再灌注組比較,#P<0.01。

圖5 RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞NF-κB及Caspase-3mRNA水平 缺血再灌注組與正常組比較,*P<0.01;缺血后處理組與缺血再灌注組比較,#P<0.01。

腦缺血再灌注損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，但越來越多的證據(jù)表明其與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注后出現(xiàn)的神經(jīng)損傷可能是通過氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)或線粒體功能障礙，最終激活凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[7]。腦缺血性損傷的機(jī)制和心肌缺血性損傷有很多相似的方面，如炎癥反應(yīng)、自由基的生成、細(xì)胞凋亡和壞死，類似的細(xì)胞信號(hào)通路導(dǎo)致細(xì)胞死亡[8-10]。本研究通過對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行糖氧剝奪后正常培養(yǎng)來模擬缺血再灌注現(xiàn)象，探討缺血后處理對(duì)缺血再灌注損傷引起的細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制。細(xì)胞凋亡分為Caspase依賴性的與非依賴性兩類。Caspase家族介導(dǎo)了細(xì)胞的程序性死亡，是細(xì)胞凋亡過程中主要的終末剪切酶。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)凋亡多由其上游因子激活，導(dǎo)致效應(yīng)分子作用于細(xì)胞中的一系列底物，最終引起細(xì)胞解體。本實(shí)驗(yàn)用Hoechst染色及蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示缺血后處理組致密濃染的細(xì)胞核較缺血再灌注組明顯減少，且缺血后處理組Cleaved caspase-3蛋白水平較缺血再灌注組明顯降低，說明缺血后處理可以降低缺血再灌注損傷引起的細(xì)胞凋亡。

多條信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，如NF-κB/p65途徑、蛋白激酶C途徑、MAPK途徑等。核因子(NF-κB)作為一種普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，是多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯聚點(diǎn)，NF-κB的典型代表是p50 /p65異源二聚體，NF-κB/p65在缺血引起的程序性細(xì)胞死亡包括細(xì)胞凋亡和自噬死亡中起重要作用。在生理狀態(tài)的靜息細(xì)胞中NF-κB與其抑制蛋白IκB(inhibitor of NF-κB，IκB α)形成復(fù)合物IκB-NF-κB主要存在于胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到外界因素缺血和缺氧等刺激時(shí)NF-κB與IκB解離被激活，并從細(xì)胞質(zhì)遷移到細(xì)胞核中。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在各種應(yīng)激對(duì)大腦有損害的情況下NF-κB/p65 被激活，如短暫性腦缺血發(fā)作、蛛網(wǎng)膜下腔出血、創(chuàng)傷和癲癇[11-14]。Nakai等證明了NF-κB/p65的激活促使癲癇引起的大鼠紋狀體神經(jīng)細(xì)胞凋亡[11]。Zhang等在研究短暫性腦缺血發(fā)作的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，NF-κB/p65激活與神經(jīng)元損傷密切相關(guān)，且抑制NF-κB/p65活化對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用[14]。本實(shí)驗(yàn)蛋白免疫印跡及RT-PCR結(jié)果顯示缺血后處理組NF-κB/p65的表達(dá)水平較缺血再灌注損傷組明顯降低，且Caspase-3的表達(dá)水平與其保持一致，提示缺血后處理的保護(hù)機(jī)制之一可能通過是抑制NF-κB/p65信號(hào)通路來抑制PC12細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為缺血后處理可以降低PC12細(xì)胞缺血再灌注損傷引起的細(xì)胞凋亡，這種降低細(xì)胞凋亡的作用可能與NF-κB/p65信號(hào)通路有關(guān)。但缺血后處理是通過什么分子途徑調(diào)控NF-κB/P65信號(hào)通路的表達(dá)還需要進(jìn)一步深入研究。作為一種新興的、簡單的腦保護(hù)方法，腦缺血后處理為臨床上治療缺血性腦卒中提供了新的思路，且NF-κB/p65也可以為缺血性腦血管病的治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。

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(2015-12-11收稿)

The effect and mechanism of ischemic postconditioning on PC12 cell apoptosis induced by ischemia/reperfusion injury

GuoXiaojie,MaoShanping,DongHuimin,etal.

DepartmentofNeurology,RenminHospital,WuhanUniversity,Wuhan430060

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect and the probable mechanism of ischemic postconditioning on PC12 cell apoptosis induced by ischemia/reperfusion injury. MethodsThe PC12 cells were divided into 3 groups: the control group, the ischemia/reperfusion group, and the ischemic postconditioning group. The ischemia/reperfusion group was subjected to a 12-hour oxygenglucose deprivation. The ischemic postconditioning group was given three cycles of 10 minutes of normal cultivation after a 12-hour oxygenglucose deprivation, and then 10 minutes of oxygenglucose deprivation. The PC12 cells were cultivated normally. Afterward the apoptosis of PC12 cells were evaluated by fluorescence microscope. Western blot was used to detect the protein level of cleaved caspase-3 and phosphorylated p65. Reverse transcription-PCR(RT-PCR)was used to observe the mRNA level of NF-κB and Caspase-3. ResultsHoechst staining showed ischemic postconditioning can reduce cell apoptosis caused by ischemia and reperfusion injury. Compared with the control group, the expression of Caspase-3 and NF-κB/p65 increased in the PC12 cells treated with ischemia/reperfusion procedure. The level of NF-κB/p65 and Caspase-3 significantly reduced in ischemia postconditioning group. ConclusionNF-κB/p65 signal pathway may be involved in the protection of ischemic postconditioning against apoptosis of PC12 cells induced by ischemia/reperfusion injury.

【Key words】Ischemic postconditioning PC12 cellsNF-κB/p65Apoptosis

【中圖分類號(hào)】R743

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1007-0478(2016)02-0075-05

基金項(xiàng)目：武漢市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)為2013060602010270)