史紅陽， 鄧文靜， 張玉萍， 張德信(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，西安　710004; 通訊作者，E-mail：shihy2003@126.com)

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胚胎發(fā)育相關(guān)基因-1對人肺癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響

史紅陽*， 鄧文靜， 張玉萍， 張德信(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，西安710004;*通訊作者，E-mail：shihy2003@126.com)

摘要：目的探討一種新近克隆的胚胎發(fā)育相關(guān)基因-1(embryonic development associated gene-1，EDAG-1)對人肺癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響。方法構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-EDAG-1，以脂質(zhì)體法穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入人肺癌細(xì)胞A549和H460，分別通過qRT-PCR和Western blot檢測EDAG-1基因mRNA和蛋白的表達(dá)，同時檢測細(xì)胞的增殖及凋亡。結(jié)果轉(zhuǎn)染EDAG-1后，A549和H460細(xì)胞中EDAG-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著性升高(P<0.01)。與轉(zhuǎn)染空載體的A549和H460對照組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染EDAG-1的A549和H460細(xì)胞增殖明顯受到抑制，細(xì)胞凋亡率顯著性升高(P<0.01)。結(jié)論EDAG-1可以抑制肺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，其可能在肺癌的發(fā)生中起著重要作用。

關(guān)鍵詞：胚胎發(fā)育相關(guān)基因；肺癌；基因表達(dá)；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

惡性腫瘤中存在可自我更新及多向分化成各種癌細(xì)胞的初始未分化癌細(xì)胞[1]。有關(guān)研究證實(shí)多種調(diào)控基因，如c-myc，n-myc，c-myb，p53，c-fos，c-ski等，參與細(xì)胞增殖、分化與癌變過程。研究調(diào)控基因作用將有助于揭示細(xì)胞惡性變化的生物學(xué)機(jī)制。定位于9q22的胚胎發(fā)育相關(guān)基因-1(embryonic develop associated gene-1，EDAG-1)，該基因mRNA穩(wěn)定性差，半衰期短[2,3]，其mRNA 3′端非翻譯區(qū)序列含2個拷貝AUUUA結(jié)構(gòu)，而該結(jié)構(gòu)多出現(xiàn)于生長因子及原癌基因的3′端序列[4]。據(jù)此，EDAG-1可能具有重要的生物學(xué)意義。

大量研究報道表明，EDAG-1基因參與調(diào)控細(xì)胞增殖與分化過程，在某種程度上其高表達(dá)與維持細(xì)胞未分化狀態(tài)有關(guān)[2]，可能與基因表達(dá)發(fā)生改變或脫離正常調(diào)控途徑有關(guān)。分子機(jī)制研究表明，EDAG通過某些途徑激活c-myc、Bcl-2及Bcl-xl等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)[2,5-8]。EDAG在多種白血病細(xì)胞系(如K562、KG-la、Jukret、Namalva細(xì)胞系)中表達(dá)水平均較高，而在HL-60、NB4和6J-1細(xì)胞系中則沒有表達(dá)[9]。采用電轉(zhuǎn)染法將過表達(dá)EDAG質(zhì)粒高效轉(zhuǎn)染至TF-1細(xì)胞株中，撤除細(xì)胞因子后其存活及抗凋亡能力均得以提高，即EDAG過表達(dá)能抑制由細(xì)胞因子撤除而誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[10]。EDAG轉(zhuǎn)染人白血病細(xì)胞系K562后能明顯提高其增生能力，與細(xì)胞內(nèi)自激因子作用機(jī)制相似[11]。而EDAG敲除小鼠對低劑量輻射誘導(dǎo)的損傷更加敏感[12]。急性白血病患者中EDAG高表達(dá)與治療效果相關(guān)[13]。分析EDAG-1基因高表達(dá)的原因，可能是某些改變使其表達(dá)脫離正常調(diào)控途徑[14]。

目前認(rèn)為肺癌的發(fā)生與細(xì)胞增殖、分化及凋亡的失衡相關(guān)，是導(dǎo)致其無限制生長的重要原因。EDAG是一種造血組織特異表達(dá)，對造血細(xì)胞增殖、分化起重要調(diào)控作用的新基因[2,13]，可能參與了造血發(fā)生多個過程的調(diào)控，但對其功能及作用機(jī)制尚缺乏深入的了解。既往研究發(fā)現(xiàn)，EDAG-1基因與細(xì)胞增殖與分化調(diào)控密切相關(guān)，且其可能參與細(xì)胞的凋亡過程[2,13,15]。EDAG-1在正常人肺組織中表達(dá)量極低或不表達(dá)[4]，其在肺癌中的表達(dá)尚不明確?；诖?，本文擬探討EDAG-1基因與肺癌的關(guān)系。因此，通過體外構(gòu)建EDAG-1真核表達(dá)載體并將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入人肺癌細(xì)胞系內(nèi)，觀察重組pcDAN3.1(+)-EDAG-1真核表達(dá)載體對細(xì)胞增殖及凋亡的影響，探討EDAG-1對于肺癌惡性生物學(xué)行為的影響。

1材料與方法

1.1菌株、質(zhì)粒、細(xì)胞、試劑

EDAG-1基因片段(約1 500 bp)由上海Sangon公司合成。大腸桿菌JM109由本實(shí)驗(yàn)室保存；真核表達(dá)載體pcDNA3.1質(zhì)粒購自于美國Invitrogen公司。人肺癌細(xì)胞株(A549，H460)系本實(shí)驗(yàn)室保存，37 ℃、5%CO2完全飽和濕度下培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640中。Western blot試驗(yàn)試劑與Taqman MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自于日本Takara公司。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000與質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自美國Promega公司。

1.2pcDNA3.1(+)-EDAG-1表達(dá)載體的構(gòu)建

將EDAG-1基因片段連接至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中，使用100 mg/L氨芐青霉素篩選出兩種以上陽性克隆，選取幾個克隆經(jīng)PCR和EcoRⅠ+XhoⅠ雙酶切檢測陽性菌落，并小量制備質(zhì)粒，進(jìn)行DNA測序。

1.3pcDNA3.1(+)-EDAG-1表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染及鑒定

常規(guī)培養(yǎng)A549和H460肺癌細(xì)胞系，取對數(shù)生長期細(xì)胞重懸，以1.0×106-2.5×106個分別接種至60 mm 96孔板中。待70%-80%細(xì)胞融合后，使用陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)載體(8 μg/孔)進(jìn)行重組載體轉(zhuǎn)染。6-8 h后換液，連續(xù)培養(yǎng)24 h，10倍稀釋細(xì)胞后施加篩選壓力，改用含G418培養(yǎng)基培養(yǎng)，每3 d換1次培養(yǎng)液，14 d后挑選并保存單克隆細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPM1640培養(yǎng)液中。

1.4Western blot檢測EDAG-1蛋白表達(dá)水平

取對數(shù)生長期轉(zhuǎn)染細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個，預(yù)冷PBS沖洗2次后加入400 μl RIPA(臨用前加入PMSF以抑制蛋白酶肽)于冰上裂解細(xì)胞30 min，4 ℃ 12 000×g離心30 min，移取上清液定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。目標(biāo)條帶電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用含50 g/L脫脂奶粉的1×TBS-T 4 ℃封閉過夜，一抗(C末端單抗)按1∶2 000反應(yīng)60 min，TBS-T沖洗4次；二抗按1∶2 000反應(yīng)60 min，TBS-T沖洗4次后顯影。

1.5Real-time PCR檢測EDAG-1 mRNA表達(dá)

按照Trizol使用說明書提取A549和H460細(xì)胞系的總RNA，使用紫外分光光度計測定其濃度。然后按照Taqman MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將cDNA加入到Taqman MicroRNA real-time PCR試劑盒中，在RT-PCR儀上進(jìn)行定量。采用2-ΔΔCt方法分析EDAG-1在不同細(xì)胞中的相對表達(dá)水平。

1.6MTT檢測細(xì)胞增殖

取轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染EDAG-1的肺癌細(xì)胞系)及對照組(轉(zhuǎn)染空載體的肺癌細(xì)胞系)細(xì)胞，以2×103個/孔接種于96孔板后加入無血清培養(yǎng)液，置于37 ℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d。每天檢測細(xì)胞含量。待穩(wěn)定后，每孔先加入10 μl(5 g/L)的MTT溶液，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，然后換液，每孔加入150 μl二甲亞砜，放入搖床中輕微振蕩直至MTT完全溶解并轉(zhuǎn)化生成紫色甲臜。用酶標(biāo)儀檢測各孔在490 nm處的吸光度。

1.7細(xì)胞凋亡的檢測

取轉(zhuǎn)染組及對照組細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。嚴(yán)格按照Annexin-V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，將細(xì)胞(2×105個)加入到100 μl 1×Binding緩沖液重懸，添加2.5 μl Annexin Ⅴ-FITC和5 μl PI染料，振蕩混勻，暗處放置10 min，然后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，計算凋亡細(xì)胞數(shù)量。應(yīng)用Western blot檢測凋亡蛋白caspase-3和Bcl-2的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)方法同1.4。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用配對樣品t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1pcDNA3.1(+)-EDAG-1載體的轉(zhuǎn)染與鑒定

將構(gòu)建載體分別進(jìn)行PCR和酶切驗(yàn)證，結(jié)果顯示，產(chǎn)物大小與合成EDAG-1片段一致(見圖1)。上述結(jié)果表明，EDAG-1真核載體已成功構(gòu)建。

M.Marker；1.pcDNA3.1(+)-EDAG-1載體PCR產(chǎn)物，大小約為1 492 bp；2.EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切空載體pcDNA3.1；3.9EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-EDAG -EDAG-1圖1　pcDNA3.1(+)-EDAG-1 PCR與酶切結(jié)果Figure 1　PCR and enzyme digestion results of pcDNA3.1(+)-EDAG-1

2.2EDAG-1的mRNA表達(dá)

將轉(zhuǎn)染組用Real-time PCR檢測其mRNA表達(dá)情況。結(jié)果表明，A549轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中EDAG-1的mRNA表達(dá)水平較A549對照組明顯增高；H460轉(zhuǎn)染組的EDAG-1的mRNA表達(dá)水平較H460對照組亦明顯提高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見圖2)。

2.3EDAG-1的蛋白表達(dá)

與EDAG-1mRNA表達(dá)結(jié)果相一致，A549轉(zhuǎn)染組及H460轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的EDAG-1蛋白表達(dá)水平分別較其對照組有明顯升高(β-actin為內(nèi)參，見圖3)。

1.A549對照組；2.A549轉(zhuǎn)染組；3.H460對照組；4.H460轉(zhuǎn)染組與其相應(yīng)對照組比較，**P<0.01圖2　qRT-PCR檢測EDAG-1的mRNA表達(dá)Figure 2　Expression of EDAG-1 mRNA after transfection by qRT-PCR

1.A549對照組;2.A549轉(zhuǎn)染組;3.H460對照組;4.H460轉(zhuǎn)染組圖3　Western blot檢測EDAG-1的蛋白表達(dá)Figure 3　Protein expression of EDAG-1 after transfection by Western blot

2.4過表達(dá)EDAG-1對肺癌細(xì)胞增殖的影響

將A549及H460轉(zhuǎn)染組與A549及H460對照組細(xì)胞在相同條件下培養(yǎng)96 h，采用MTT法測定生長曲線(λ=490 nm)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，72 h和96 h時轉(zhuǎn)染組較對照組的細(xì)胞增殖速度明顯減慢，具有顯著性差異(P<0.01，見圖4)，即轉(zhuǎn)染EDAG-1可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖。

A.A549細(xì)胞　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　B.H460細(xì)胞　與其相應(yīng)對照組比較，**P<0.01圖4　EDAG-1對肺癌細(xì)胞增殖的影響Figure 4　Effects of EDAG-1 on proliferation of lung cancer cell line

2.5過表達(dá)EDAG-1對肺癌細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，A549及H460轉(zhuǎn)染組肺癌細(xì)胞的凋亡率明顯高于其相應(yīng)對照組(P<0.01，見圖5)。與其相應(yīng)對照組比較，轉(zhuǎn)染組的caspase-3表達(dá)量較高，而Bcl-2的表達(dá)量較低(β-actin為內(nèi)參，見圖6)，這與流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果相一致，表明高表達(dá)EDAG-1促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡。

1.A549對照組； 2.A549轉(zhuǎn)染組； 3.H460對照組； 4.H460轉(zhuǎn)染組與其相應(yīng)對照組比較，**P<0.01圖5　EDAG-1對肺癌細(xì)胞凋亡的影響Figure 5　Effect of EDAG-1 on the apoptosis of lung cancer cell line

1.A549對照組；2.A549轉(zhuǎn)染組；3.H460對照組；4.H460轉(zhuǎn)染組圖6　EDAG-1對肺癌細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白的影響Figure 6　Effect of EDAG-1 on the apoptosis-related protein expression of lung cancer cells

3討論

EDAG-1是一種與細(xì)胞增殖、分化調(diào)控相關(guān)的新型基因。相關(guān)研究證實(shí)，該基因主要分布在人胚胎肝及骨髓等造血組織，常高表達(dá)于多種白血病細(xì)胞株及白血病患者外周血中。進(jìn)而研究人員推測EDAG-1基因與細(xì)胞，特別是血液細(xì)胞，增殖、分化調(diào)控等密切相關(guān)，且該基因高表達(dá)可能與細(xì)胞維持未分化或低分化狀態(tài)相關(guān)[16]。其基因產(chǎn)物是核蛋白，可能與其他核內(nèi)因子作用后間接發(fā)揮作用[3]。Yang等[3]在解析EDAG表達(dá)蛋白的氨基酸序列時發(fā)現(xiàn)，EDAG基因內(nèi)部存在核定位信號與環(huán)繞結(jié)構(gòu)域，指示與其他蛋白聚合的可能性，但具體功能與相關(guān)蛋白仍未獲知。肺癌是我國發(fā)病率較高的癌癥之一。EDAG-1在正常人肺組織中表達(dá)量極低或不表達(dá)[4]。但其在肺癌中的表達(dá)尚不明確。本研究將體外合成的EDAG-1基因亞克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)上，并通過脂質(zhì)體介導(dǎo)成功轉(zhuǎn)染至人肺癌細(xì)胞株中。研究表明，轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞和H460細(xì)胞均過表達(dá)EDAG-1；同時過表達(dá)EDAG-1可抑制肺癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。

經(jīng)證實(shí)，Bcl-2蛋白是細(xì)胞凋亡抑制成分。作為Bcl-2家族中的主要成員，Bcl-2在凋亡信號傳導(dǎo)過程中，常作為caspase的上游調(diào)控機(jī)制[17]。多數(shù)情況下，過量表達(dá)的Bcl-2能有效抑制住各種因素所誘發(fā)的caspase激活和凋亡。Zhan等[18]報道了Bcl-2可阻止具腎毒性的順鉑誘導(dǎo)的腎上皮細(xì)胞caspase-3的激活與凋亡。而Bcl-2轉(zhuǎn)基因后的高表達(dá)抑制了caspase-3和caspase-6的激活和其他凋亡事件[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，EDAG-1轉(zhuǎn)染組的肺癌細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組(轉(zhuǎn)染空載體)，且轉(zhuǎn)染組的caspase-3表達(dá)量較高，Bcl-2表達(dá)量較低，表明高表達(dá)EDAG-1可能通過Bcl-2家族及caspase-3家族促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

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Effects of embryonic development associated gene-1 on the proliferation and apoptosis of human lung cancer cell lines

SHI Hongyang*, DENG Wenjing, ZHANG Yuping, ZHANG Dexin

(DepartmentofRespiratoryMedicine,SecondAffiliatedHospitalofMedicalCollege,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004，China;*Correspondingauthor,E-mail：shihy2003@126.com)

Abstract：ObjectiveTo explore the effects of newly-cloned embryonic development associated gene-1(EDAG-1) on proliferation and apoptosis of human lung cancer cells. MethodsThe eukaryotic expression vector, pcDNA3.1(+)-EDAG-1, was successfully constructed and stably transfected into the A549 and H460 cells by liposome method. Then the EDAG-1 mRNA and protein expression levels were determined by qRT-PCR and Western blot, respectively. At the same time, the proliferation and apoptosis of cells were detected.ResultsAfter transfection, the mRNA and protein expression levels of EDAG-1 in A549 and H460 cells were significantly increased(P<0.01). Compared with A549 and H460 cells transfected with empty vectors, the proliferation of A549 and H460 cells transfected with EDAG-1 was significantly inhibited, and the apoptosis rate was significantly increased(P<0.01). ConclusionEDAG-1 can inhibit the proliferation of lung cancer cells and promote its apoptosis, which may play an important role in the occurrence of lung cancer.Key words:EDAG-1;lung cancer;gene expression;proliferation;apoptosis

[收稿日期：2015-11-13]

作者簡介：史紅陽，女，1976-07生，博士，主治醫(yī)師，E-mail:shihy2003@126.com.

中圖分類號：R734.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)01-0026-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.01.007

基金項(xiàng)目：中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(XJJ2012057)；西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院科研基金資助項(xiàng)目(Yj(QN)201101)