紅 艷 達(dá)拉胡 辛 穎

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

蒙藥梅花草乙醇提取物對(duì)肝癌細(xì)胞增殖作用的實(shí)驗(yàn)研究△

紅 艷 達(dá)拉胡 辛 穎*

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

目的：研究蒙藥梅花草的乙醇提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞(HepG2細(xì)胞)的體外增殖抑制作用。方法:采用MTT法檢測(cè)梅花草乙醇提取物的不同劑量組對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用；ELISA檢測(cè)HepG2細(xì)胞內(nèi)Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)變化情況。結(jié)果:梅花草乙醇提取物處理HepG2細(xì)胞24h后，可以明顯抑制HepG2細(xì)胞的增殖。與對(duì)照組相比，梅花草的乙醇提取物可以明顯升高HepG2細(xì)胞的Bax蛋白水平，降低Bcl-2蛋白水平(P<0.05和P<0.05)。結(jié)論:蒙藥梅花草的乙醇提取物體外對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖有抑制作用，其作用機(jī)制與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡有關(guān)。

梅花草乙醇提取物；HepG2細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；Bax；Bcl-2

梅花草(Parnassis palustris L.)為虎耳草科梅花草屬植物突隔梅花草的全草或根，又稱(chēng)白側(cè)草、馬蹄草等，是蒙古族歷代和民間常用的特色蒙藥，蒙古名為那木戛納、烏力地格和那木日因查干-其其格等。在現(xiàn)代蒙醫(yī)臨床應(yīng)用是用于治療腫瘤及其相關(guān)疾病的常用蒙藥材之一。梅花草氣味甘、苦，無(wú)明顯毒性，具有清熱解毒、破痞、消腫排膿和抑希日等功效，臨床主要用于治療腑器熱性希日病和熱性痞癥，即治療肝、膽腫瘤及部分腸道腫瘤(如結(jié)腸腫瘤)等，也可以治療黃疸型肝炎、咽喉炎、腮腺炎、脈管炎和肺結(jié)核等[1，2]。

“破痞”屬于一種蒙藥功效，相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的抗腫瘤作用?，F(xiàn)代蒙藥藥理學(xué)[3]上認(rèn)為具破痞功效的蒙藥具有抗腫瘤活性。蒙醫(yī)理論認(rèn)為“痞癥”可發(fā)生于人體的各個(gè)器官，多屬于繼發(fā)于各種疾病的郁結(jié)性痼疾，其發(fā)病原因主要是由于維持人體生命的“三根”(赫依、希日、巴達(dá)干)因某種原因失去平衡，使“七素”(食物精華、血、肉、脂、骨、骨髓、精液)的轉(zhuǎn)化過(guò)程中因積聚凝結(jié)而成渾濁、惡血激增、黃水淤積，在赫依的促動(dòng)作用下，在人體的某一部位形成痞塊。醫(yī)治痞病，不但要破痞瘤本身同時(shí)要判明其發(fā)病原因，對(duì)癥施治。長(zhǎng)期以來(lái)，蒙醫(yī)藥學(xué)對(duì)于“痞癥”的治療方面已經(jīng)積累了非常豐富的治療方法和傳統(tǒng)用藥經(jīng)驗(yàn)，臨床療效顯著，并且副作用小，資源豐富。但存在的挑戰(zhàn)在于如何利用現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)理念去解釋蒙醫(yī)藥“破痞”功效的根本原因和機(jī)制。

據(jù)文獻(xiàn)查閱，目前未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家和學(xué)者關(guān)于蒙藥梅花草的“破痞”功效的活性化學(xué)成分和作用機(jī)制等方面的研究報(bào)道。從天然藥物的發(fā)展趨勢(shì)來(lái)看，應(yīng)該將化學(xué)成分和藥效學(xué)研究結(jié)合起來(lái)進(jìn)行研究，應(yīng)該以天然藥物的有效部位為切入點(diǎn)，對(duì)其有效部位進(jìn)行提取分離，了解其主要活性成分，再進(jìn)一步尋找其作用機(jī)制。本研究沿著天然藥物研究的這一思路，首先擬用活性追蹤法對(duì)蒙藥梅花草乙醇提取物的抗腫瘤作用進(jìn)行研究，旨在通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)初步評(píng)價(jià)梅花草的乙醇提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞(HepG2細(xì)胞)的增殖是否具有抑制作用，進(jìn)一步研究梅花草的抗腫瘤效果。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞：人肝癌細(xì)胞系(HepG2細(xì)胞)購(gòu)自上海博谷生物科技有限公司。

1.2 儀器：TS100倒置相差顯微鏡(日本尼康)；SW-CJ-2F雙人雙面凈化工作臺(tái)(蘇州智凈有限公司)；DNM-9602酶標(biāo)(北京普朗責(zé)任有限公司)；3110系列水套CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific)；GYJ1/2-40L-S超純水機(jī)(重慶華創(chuàng)責(zé)任有限公司)；YXQ-LS-100A立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊有限公司)；DHG-9203A鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏有限公司)；98-1B型電子調(diào)溫電熱套(天津市秦斯特儀器有限公司)；KQ-100型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)Heidolph集團(tuán))；SHZ-DIII循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城儀器有限公司)；96孔培養(yǎng)板及培養(yǎng)瓶(美國(guó)Corning公司)。

1.3 試劑：DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；MTT(北京索萊寶科技有限公司)；胰酶(北京索萊寶科技有限公司)；人B細(xì)胞淋巴瘤因子-2(Bcl-2)ELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)；人Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)ELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)；生理鹽水、乙醇、二甲基亞砜(DMSO)等試劑均購(gòu)自天津科密歐公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物制備：取一定量的梅花草(500g)，用95%的乙醇浸泡后放于大圓底燒瓶中加熱浸煮，每次煮3h，提取3次，每次所得的煮液合并為提取液，減壓濃縮干燥后得浸膏，備用。經(jīng)計(jì)算得提取率為33.26%。用DMSO作為梅花草乙醇提取物的溶劑。

2.2 MTT實(shí)驗(yàn)：HepG2細(xì)胞消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，接種于96孔板中，每孔100μL，培養(yǎng)24h，加入不同濃度的梅花草乙醇提取物，使終濃度為3.125、4.167、6.25、12.5mg/mL，置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h，棄培養(yǎng)液，每孔加MTT溶液(5mg/mL)50μL，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)MTT，每孔加100μLDMSO，振蕩2～3min，使結(jié)晶物充分融解。選擇490nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔OD值，記錄結(jié)果，計(jì)算抑制率。抑制率=(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2.3 ELISA檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)：HepG2細(xì)胞加入梅花草的乙醇提取物處理24h后，用PBS洗滌2次，用ELISA方法測(cè)定細(xì)胞上清液中Bax和Bcl-2蛋白的含量。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，按著試劑盒的說(shuō)明方法進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)差異性比較采用單因素方差分析，P<0.05或P<0.01為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 梅花草乙醇提取物對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用：梅花草乙醇提取物在濃度為4.167、6.25、12.5mg/mL時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞均表現(xiàn)出抑制其增殖的作用，且隨著提取物濃度的增高而抑制作用逐漸增強(qiáng)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 梅花草乙醇提取物對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的作用

注：與對(duì)照組相比，＊P<0.05，＊＊P<0.01

3.2 梅花草乙醇提取物對(duì)HepG2細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響：與對(duì)照組相比，梅花草乙醇提取物濃度為12.5mg/mL 時(shí)Bax蛋白表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05和P<0.05)。梅花草乙醇提取物的其他濃度與對(duì)照組比較差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 梅花草乙醇提取物對(duì)HepG2細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

注：與對(duì)照組相比，＊P<0.05

4 討論

中蒙藥既可以作為抗腫瘤的手術(shù)治療、放射性治療和化學(xué)藥物治療的輔助用藥，又可以獨(dú)立發(fā)揮直接的抗腫瘤作用。它防治腫瘤的作用機(jī)理一般是比較復(fù)雜的，常常涉及到多個(gè)靶點(diǎn)、多條途徑和多種環(huán)節(jié)的共同作用，包括抑制腫瘤自身血管的生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)機(jī)體自體免疫的功能、誘導(dǎo)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡和分化、調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多重耐藥性和抑制端粒酶活性等[4]。此外，與化學(xué)合成藥物相比，中、蒙藥還具備很多實(shí)用性的特點(diǎn)利于其應(yīng)用，比如其取材方便、價(jià)格低廉、毒副作用小等。所以中、蒙藥及其有效成分的抗腫瘤作用及其機(jī)理的研究已成為當(dāng)今醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果顯示，梅花草乙醇提取物的不同劑量組對(duì)HepG2細(xì)胞可以表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，且呈現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系。細(xì)胞凋亡是生命的基本現(xiàn)象，可以維持機(jī)體內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)平衡，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，具有十分重要的生物學(xué)意義。哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡受基因的嚴(yán)格調(diào)控，研究表明Bax和Bcl-2的表達(dá)高低與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系，其中Bax是細(xì)胞凋亡的促進(jìn)基因，Bcl-2是細(xì)胞凋亡的抑制基因，Bcl-2與Bax比值的升高會(huì)導(dǎo)致肝癌細(xì)胞凋亡發(fā)生的機(jī)率增加[5]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，梅花草乙醇提取物促進(jìn)HepG2細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)，抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)，即梅花草乙醇提取物可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。

綜上所述，梅花草乙醇提取物在體外對(duì)HepG2細(xì)胞有抑制作用，且其作用機(jī)制與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡有關(guān)。

[1]羅布桑. 蒙藥學(xué)[M]. 北京：民族出版社，1989，459-460.

[2] 奧烏力吉，布和巴特爾. 傳統(tǒng)蒙藥與方劑[M]. 呼和浩特：內(nèi)蒙古科學(xué)技術(shù)出版社，2013，08.

[3] 王秀蘭，白玉霞，王歡，等. 蒙藥藥理學(xué)[M]. 呼和浩特：內(nèi)蒙古人民出版社，2006，82-87.

[4] 尹龍，徐亮，胡格，等. 抗腫瘤中藥及其有效成分的作用研究現(xiàn)狀[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，27(1)：39-44.

[5] 龍冬梅. 細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因在大鼠肝癌促癌過(guò)程中的作用研究[D]. 第三軍醫(yī)大學(xué)(重慶)，2001.

2016年6月29日收稿

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金資助(2016MS0817)；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目(NJZZ16184)

紅艷，女，講師，從事蒙藥栽培與鑒定研究。

*通訊作者：辛穎，女，副教授，從事民族藥物研究，E-mail：xinying20081115@163.com

R291.2

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1006-6810(2016)10-0063-03