曲高婷，張愛(ài)青，施會(huì)敏，甘衛(wèi)華

(南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院　兒科，江蘇　南京　210003)

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

自噬對(duì)體外醛固酮誘導(dǎo)的大鼠系膜細(xì)胞凋亡的影響

曲高婷，張愛(ài)青，施會(huì)敏，甘衛(wèi)華

(南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院兒科，江蘇南京210003)

【摘要】目的：通過(guò)體外研究醛固酮(ALD)和蟾蜍靈(Bufalin)作用于大鼠系膜細(xì)胞后自噬與凋亡的變化,探討自噬在醛固酮誘導(dǎo)系膜細(xì)胞凋亡中的作用，進(jìn)而說(shuō)明醛固酮參與腎損傷的可能機(jī)制。 方法：體外培養(yǎng)大鼠系膜細(xì)胞,分別應(yīng)用醛固酮、蟾蜍靈、氯喹(CQ)作用于系膜細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分為a：對(duì)照組、b:ALD組(10-6mol/L 醛固酮)，c：Bufalin組(10-8mol/L 蟾蜍靈)，d：ALD+Bufalin組(10-6mol/L 醛固酮+10-8mol/L 蟾蜍靈)，e:ALD+CQ組(10-6mol/L 醛固酮+10 μmol /L氯喹)，f:ALD+Bufalin+CQ組(10-6mol/L 醛固酮+10-8mol/L 蟾蜍靈+10 μmol /L氯喹)；應(yīng)用透射電鏡觀察各組大鼠系膜細(xì)胞的自噬水平；應(yīng)用Western Blot檢測(cè)各組自噬標(biāo)志蛋白P62、LC3表達(dá)的變化；應(yīng)用An- nexin V /PI 雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組大鼠系膜細(xì)胞凋亡的變化。 結(jié)果：透射電鏡下:a組和c組未見(jiàn)典型自噬體，b組可見(jiàn)典型自噬體，d組自噬體數(shù)目小于b組，e組、f組自噬體數(shù)目均明顯高于各組；Western Blot檢測(cè)P62、LC3蛋白表達(dá)結(jié)果顯示：c組表達(dá)量與a組基本相同，b組較a、c組升高(P<0.05)；d組較b組下降(P<0.05)；e組、f組表達(dá)量基本相當(dāng)，且顯著高于各組(P<0.05)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡結(jié)果顯示:c組細(xì)胞凋亡率(46.23±5.83)%與a組(46.10±3.49)%基本相同，b組細(xì)胞凋亡率(76.47±3.03)%較a組明顯升高(P<0.05),d組(61.73±2.76)%、e組(61.03±3.62)%、f組細(xì)胞凋亡率(60.50±1.95)%基本相同，較a、c組明顯升高(P<0.05)，但較b組下降(P<0.05)。 結(jié)論：醛固酮可同時(shí)誘導(dǎo)系膜細(xì)胞自噬及凋亡增加，蟾蜍靈及氯喹可以抑制醛固酮對(duì)自噬及細(xì)胞凋亡的誘發(fā)作用，提示自噬可促進(jìn)醛固酮誘發(fā)的系膜細(xì)胞凋亡，醛固酮可能通過(guò)增加自噬從而促進(jìn)系膜細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】醛固酮;蟾蜍靈；系膜細(xì)胞;自噬;凋亡

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.02.003

醛固酮(aldosterone，ALD)是引起腎損傷的重要物質(zhì)，它可通過(guò)作用于腎臟固有細(xì)胞發(fā)揮作用。系膜細(xì)胞是腎小球內(nèi)最活躍的固有細(xì)胞，其數(shù)量、形態(tài)及位置的相對(duì)穩(wěn)定直接影響著腎臟正常結(jié)構(gòu)和功能的維持，其受損可促進(jìn)腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展。研究表明醛固酮可直接誘導(dǎo)系膜細(xì)胞凋亡，可能是醛固酮引起的腎損傷的機(jī)制之一[1]，但醛固酮如何調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不清楚。近年來(lái)，多項(xiàng)研究表明細(xì)胞自噬與多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]，且自噬與細(xì)胞凋亡間有著密不可分且錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系，自噬既可誘導(dǎo)凋亡，又可拮抗凋亡的發(fā)生[3]。因此，本研究通過(guò)觀察醛固酮，蟾蜍靈及自噬抑制劑氯喹分組作用于大鼠系膜細(xì)胞后，細(xì)胞自噬與凋亡的變化，探討系膜細(xì)胞自噬與凋亡間的關(guān)系，并為臨床應(yīng)用醛固酮受體拮抗劑和蟾蜍靈治療腎臟疾病提供相應(yīng)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)材料和儀器正常大鼠腎小球系膜細(xì)胞株[中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)]；胎牛血清、0.25% 含EDTA的胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)液(Gibco，美國(guó))；醛固酮、蟾蜍靈、氯喹(Sigma，美國(guó))；β-actin抗體(Bioworld，美國(guó))；P62抗體、LC3抗體(Sigma，美國(guó))；HRP-標(biāo)記的羊抗兔二抗、HRP-標(biāo)記的羊抗小鼠二抗(CST，美國(guó))；蛋白Marker(Thermo，加拿大)；透射電子顯微鏡(JEOL，日本)；流式細(xì)胞儀(BD,法國(guó))。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞生長(zhǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液(含青霉素 100 U /mL,鏈霉素100 μg /mL ) 中,置于37 °C、 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),每 2 天換液,當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80% 融合時(shí)用0.25%的胰酶消化傳代,取第 4～6 代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化后,以 2×105個(gè)/孔密度接種于6孔板培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至 70%～80%融合時(shí)換用無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h,使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化。實(shí)驗(yàn)分組為a組(對(duì)照組)；b組(醛固酮組：醛固酮10-6mol/L,根據(jù)既往研究確定[1])；c組(Bufalin組:蟾蜍靈10-8mol/L,根據(jù)既往研究確定[4])；d組(ALD+Bufalin組:醛固酮10-6mol /L+蟾蜍靈10-8mol/L)；e組(ALD+CQ組:醛固酮10-6mol/L+氯喹10 μmol /L)；f組(ALD+Bufalin+CQ組:醛固酮10-6mol/L+蟾蜍靈10-6mol /L+氯喹10 μmol /L)。

1.2.3透射電子顯微鏡術(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)同步化后,根據(jù)不同分組處理細(xì)胞。24 h 后PBS 洗滌細(xì)胞3 次，胰酶消化，1500 r/min 離心10 min，使細(xì)胞成團(tuán)，小心吸去上清，加入2.5%戊二醛固定2 h，送電鏡室包埋、切片、染色，透射電子顯微鏡下觀察自噬體的存在。

1.2.4Western Blot 檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白P62、LC3表達(dá)細(xì)胞生長(zhǎng)同步化后,根據(jù)不同分組處理細(xì)胞。24 h 后PBS洗滌細(xì)胞3 次，按100∶1 加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑(100 μL+1 μL)，并于冰上裂解30 min，4℃，15 000 r/min 離心10 min，取上清，加入上樣緩沖液，100℃水浴變性10 min。根據(jù)二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書測(cè)定蛋白濃度。每組按30 μg 蛋白上樣量進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，將電泳分離的樣本轉(zhuǎn)移到固相載體PVDF膜上，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，加入LC3、P62 及β-actin 一抗(工作液濃度1∶1000)于4℃孵育過(guò)夜，1×TBST漂洗一抗，加入相應(yīng)的HRP 標(biāo)記的二抗(工作液濃度1∶5000)室溫孵育2 h，1×TBST 漂洗后ECL 顯色，凝膠成像系統(tǒng)曝光并顯影。以β-actin 作為內(nèi)參，進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5An-nexin V/PI 雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡根據(jù) An-nexin V-FITC /PI 凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明操作。 細(xì)胞生長(zhǎng)同步化后,根據(jù)不同分組處理細(xì)胞。24 h后胰酶消化后收集細(xì)胞,用預(yù)冷的 PBS 洗滌細(xì)胞 2 次并離心,100 μL 預(yù)冷 binding buffer 重懸細(xì)胞,加入 5 μL An-nexin V-FITC 和 5 μL PI 混勻,避光室溫反應(yīng)10 min,加入400 μL binding buffer 終止反應(yīng),篩網(wǎng)過(guò)濾后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。 BD Accuri C6 軟件分析細(xì)胞凋亡。

2結(jié)果

2.1各組大鼠系膜細(xì)胞自噬情況比較透射電子顯微鏡下觀察，對(duì)照組、Bufalin組未見(jiàn)典型的雙層膜包裹細(xì)胞漿及細(xì)胞器的自噬體，ALD組可見(jiàn)典型自噬體，ALD+Bufalin組見(jiàn)自噬體但數(shù)目小于ALD組，ALD+CQ組見(jiàn)自噬體且數(shù)目明顯高于ALD組，ALD+Bufalin+CQ組見(jiàn)自噬體且數(shù)目高于ALD+Bufalin組但低于ALD+CQ組。見(jiàn)圖1。

a.對(duì)照組；b.ALD組；c.Bufalin組；d.ALD+Bufalin組；e.ALD+CQ組；f.ALD+Bufalin+CQ組。

圖1大鼠系膜細(xì)胞自噬的變化

2.2各組自噬相關(guān)蛋白P62和LC3表達(dá)比較Western Blot結(jié)果顯示，各組間自噬相關(guān)蛋白P62存在顯著差異(F=480.11，P=0.000)。b組P62蛋白表達(dá)較a組明顯升高(P=0.000)；c組P62蛋白表達(dá)較a組無(wú)明顯變化，d組P62蛋白表達(dá)較b組明顯降低(P=0.000)，d組P62蛋白表達(dá)較c組顯著升高(P=0.000)，e組P62蛋白表達(dá)較b組顯著升高(P=0.000)，f組P62蛋白表達(dá)較e組無(wú)明顯變化，f組P62蛋白表達(dá)較d組顯著升高(P=0.000，圖2A、B)。

Western Blot結(jié)果顯示，各組間自噬相關(guān)蛋白LC3存在顯著差異(F=179.53，P=0.000)。b組LC3蛋白表達(dá)較a組明顯升高(P=0.000)；c組LC3蛋白表達(dá)較a組無(wú)明顯變化，d組LC3蛋白表達(dá)較b組明顯降低(P=0.000)，d組LC3蛋白表達(dá)較c組顯著升高(P=0.000)，e組LC3蛋白表達(dá)較b組顯著升高(P=0.000)，f組LC3蛋白表達(dá)較e組無(wú)明顯變化，f組LC3蛋白表達(dá)較d組顯著升高(P=0.000，圖2A、C)。

a.對(duì)照組；b.ALD組；c.Bufalin組；d.ALD+Bufalin組；e.ALD+CQ組；f.ALD+Bufalin+CQ組；*P<0.05vsa組；#P<0.05vsb組；△P<0.05vsc組；&P<0.05vsd組。

圖2自噬相關(guān)蛋白P62和LC3表達(dá)的變化

2.3各組大鼠系膜細(xì)胞凋亡的變化流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，a組細(xì)胞凋亡率(46.10±3.49)%，b組細(xì)胞凋亡率(76.47±3.03)%，c組細(xì)胞凋亡率(46.23±5.83)%；d組細(xì)胞凋亡率(61.73±2.76)%，e組細(xì)胞凋亡率(61.03±3.62)%，f組細(xì)胞凋亡率(60.50±1.95)%，各組細(xì)胞凋亡率存在顯著差異(F=95.55，P=0.000)，見(jiàn)圖3。c組與a組細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著差異，b組細(xì)胞凋亡率較a組顯著升高(P=0.000)，d組、e組和f組細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著差異，但與a組和c組比較均有明顯升高(P=0.000)，和b組比較顯著降低(P=0.000)。

a.對(duì)照組；b.ALD組；c.Bufalin組；d.ALD+Bufalin組；e.ALD+CQ組；f.ALD+Bufalin+CQ組；*P<0.05vsa組；#P<0.05vsb組；P<0.05vsc組。

圖3大鼠系膜細(xì)胞凋亡的變化

3討論

所有腎臟疾病均可能進(jìn)展為慢性腎衰竭，進(jìn)而嚴(yán)重影響人類生命長(zhǎng)度及質(zhì)量，尋找新的延緩或阻止腎臟損害的治療方法十分重要。研究顯示醛固酮可能作為一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素直接參與腎損害[5]。系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞等腎臟固有細(xì)胞的凋亡(又稱Ⅰ型程序性細(xì)胞死亡)在腎臟損害的發(fā)生發(fā)展中，扮演著至關(guān)重要的角色[6-9]，醛固酮被證實(shí)可誘導(dǎo)系膜細(xì)胞凋亡[1]，但其機(jī)制目前研究甚少。

自噬又稱Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，是一個(gè)吞噬自身細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器并使其包被進(jìn)入囊泡,形成自噬體,并與溶酶體融合形成自噬溶酶體,降解其所包裹的內(nèi)容物的過(guò)程,藉此實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新。在細(xì)胞饑餓、生長(zhǎng)因子缺乏時(shí)，自噬對(duì)維持細(xì)胞的存活起到一定的積極作用，而過(guò)度的自噬可引起細(xì)胞死亡。自噬參與足細(xì)胞、腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等腎臟固有細(xì)胞的損傷[9]，在急性和慢性腎臟疾病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?自噬已被證明對(duì)腎細(xì)胞的存活至關(guān)重要[11]，干預(yù)腎疾病細(xì)胞的自噬,可能會(huì)阻止腎臟疾病的進(jìn)展。自噬與凋亡間關(guān)系密切而復(fù)雜，某些情況下，細(xì)胞因應(yīng)激誘導(dǎo)自噬增強(qiáng)，從而避免了凋亡；而另一些情況下，過(guò)度的自噬又可導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡[12-13]，二者的動(dòng)態(tài)平衡或失衡決定了細(xì)胞的生存或死亡，因此闡明自噬和凋亡的動(dòng)態(tài)關(guān)系對(duì)細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)歸的作用機(jī)制具有重要意義,也有助于尋找治療腎臟疾病的有效措施。

在細(xì)胞自噬的研究中,用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞質(zhì)中雙層膜包裹所形成的自噬體是評(píng)估自噬的形態(tài)學(xué)金標(biāo)準(zhǔn)。LC3是一種自噬相關(guān)蛋白，在自噬體形成中起核心作用，胞漿可溶性LC3.Ⅰ在泛素樣修飾后,與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合,形成LC3.Ⅱ被募集到自噬前體上,形成自噬體,LC3.Ⅱ含量與自噬泡數(shù)量成正比,可用于判斷自噬水平的高低[14]。P62蛋白,通過(guò)LRS結(jié)構(gòu)域與LC3相互作用而定位在自噬體上,其C末端結(jié)構(gòu)域連接泛素化蛋白,并引導(dǎo)自噬體進(jìn)行選擇性降解，當(dāng)自噬功能障礙時(shí),聚集在自噬體上的P62不能被降解,導(dǎo)致P62蛋白水平明顯增高[15]。因此,P62是評(píng)價(jià)自噬體降解的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示ALD組可見(jiàn)典型自噬體，LC3、P62表達(dá)量及細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯升高；Bufalin組未見(jiàn)典型自噬體，LC3、P62表達(dá)量及細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組基本相同，但較ALD組明顯下降；ALD+Bufalin組見(jiàn)自噬體較ALD組減少，LC3、P62表達(dá)量及細(xì)胞凋亡率較ALD組下降；ALD+CQ組見(jiàn)自噬體明顯多于ALD組，LC3、P62表達(dá)量較ALD組顯著升高，但細(xì)胞凋亡率較ALD組下降；ALD+ Bufalin+CQ組見(jiàn)自噬體多于ALD+Bufalin組，但少于ALD+CQ組，LC3、P62表達(dá)量及細(xì)胞凋亡率與ALD+CQ組基本相同。上述結(jié)果提示醛固酮可誘導(dǎo)系膜細(xì)胞自噬及凋亡，蟾蜍靈可抑制醛固酮誘導(dǎo)系膜細(xì)胞自噬及凋亡，自噬抑制氯喹通過(guò)組織自噬體與溶酶體結(jié)合抑制自噬，造成自噬體堆積，同時(shí)抑制凋亡。

綜上提示醛固酮可能誘導(dǎo)系膜細(xì)胞自噬促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這可能是引起的腎損傷的機(jī)制之一。因此本研究結(jié)果可以為醛固酮在腎損害的作用機(jī)制研究中提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)，并為醛固酮抑制劑、蟾蜍靈及氯喹治療相應(yīng)腎臟疾病提供依據(jù)。

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Effects of autophagy on the apoptosis of mesenteric cells induced by aldosterone in rats with

invitrotechniqueQUGaoting,ZHANGAiqing,SHIHuimin,GANWeihua

Department of Pediatrics,The Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210003,China

【Abstract】Objective： To investigate the potential mechanisms of renal injury associated with aldoserone(ALD) through observing the effects of autophagy on the apoptosis of mesenteric cells(MCs) induced by ALD and bufalin in rats with in vitro techniques.Methods:The mesenteric cells in rats were cultured with in vitro technique and induced with ALD,bufalin and chloroquine phosphate(CQ),respectively.Then rats were divided into groups of controls(group A),treated with ALD(10-6mol/L,group B),bufalin(10-8mol/L,group C),ALD+Bufalin(10-6mol/L +10-8mol/L,group D),ALD+CQ(10-6mol/L+10 μmol /L,group E) and ALD+Bufalin+CQ(10-6mol/L+10-8mol/L+10 μmol /L,group F).Transmission electron microscope was used to observe the autophagy in the mesenteric cells in each group of rats,and Western Blot was performed to determine the protein changes of P62 and LC3 suggestive of autophagy.Cellular apoptosis was detected with An-nexin V /PI flow cytometry.Results:Transmission electron microscopy showed no typical autophagosome in group A and C,yet prominent autophagosome in group B.Lower autophagosomes were seen in group D,whereas higher autophagosomes were found in group E and F.Western blotting revealed similar level of P62 and LC3 protein in group C to group A,yet higher level in group A than that of group A and C(P<0.05),lower level in group D than that of group B(P<0.05).Level of P62 and LC3 protein in group E was comparable to that of group F,yet the level was higher than remaining groups(P<0.05).Flow cytometry indicated the rate of cellular apoptosis of (46.23 ±5.83)% in group C and (46.10±3.49)% in group A.Although group B had higher incidence of apoptosis (76.47 ±3.03)% than group group A(P<0.05),yet it remained similar among groups of group D(61.73 ±2.76)%,group E(61.03 ±3.62)% and group F(60.50±1.95)%.However,apoptosis was higher in group A and C,and lower in group B (P<0.05).Conclusion:Aldosterone may induce autophagy as well as apoptosis of the mesenteric cells,and bufalin and chloroquine can inhibit the autophagy and apoptosis induced by ALD.

【Key words】aldosterone;bufalin;mesenteric cells;apoptosis;autophagy

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】【中圖號(hào)】R 692A

作者簡(jiǎn)介：曲高婷(1990-)，女，2014級(jí)碩士研究生，(電話)17701596663，(電子信箱)302936422@qq.com；

收稿日期：2015-08-22

文章編號(hào)：1002-0217(2016)02-0113-05

甘衛(wèi)華，女，主任醫(yī)師，(電子信箱)weihuagan@njmu.edu.cn，通訊作者.