耿建　劉瑞霞　高西陽　李彥　潘修成　傅涓涓　李麗

221002　徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染病科

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·論著·

CHB患者Th17-Treg失衡中IL-21的作用及機(jī)制

耿建劉瑞霞高西陽李彥潘修成傅涓涓李麗

221002徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染病科

【摘要】目的研究慢性乙型肝炎(CHB)患者外周Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)失衡中IL-21的作用及其初步機(jī)制。方法流式細(xì)胞儀分別檢測59例CHB患者和20例健康人外周血細(xì)胞中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞頻數(shù)，同時以ELISA法檢測血清細(xì)胞因子IL-21、IL-17、IL-10、TGF-β水平。體外分別以IL-21、IL-2刺激CHB患者外周血單核細(xì)胞(PBMC)，以實時 PCR 檢測培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA及Foxp3 mRNA表達(dá)水平，以ELISA法檢測培養(yǎng)上清細(xì)胞因子IL-17、IL-10和TGF-β水平。結(jié)果與正常人群相比，IL-21、IL-17、TGF-β水平顯著升高(P均<0.05)，CHB患者外周Th17/Treg比例顯著升高(P<0.05), IL-21水平與Th17/Treg比例呈正相關(guān)(P=0.008)。 與IL-2相比，IL-21刺激CHB患者PBMC的RORγt mRNA表達(dá)水平明顯升高(P=0.016)而Foxp3 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P=0.018),相對應(yīng)的培養(yǎng)上清中，IL-17水平顯著上升(P=0.049)而IL-10、TGF-β水平明顯降低(P=0.017， P=0.004)。結(jié)論CHB患者中IL-21能通過提高RORγt mRNA表達(dá)，同時抑制Foxp3 mRNA表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)Th17/Treg失衡。

【關(guān)鍵詞】白介素-21；慢性乙型肝炎；Th17細(xì)胞；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

既往認(rèn)為，Th1/Th2平衡失調(diào)對慢性乙型肝炎(CHB)發(fā)揮重要作用[1]。Th17在CHB的發(fā)病中促進(jìn)炎性反應(yīng)，主要分泌IL-17、IL-21、IL-23等細(xì)胞因子；而Treg細(xì)胞能夠抑制免疫反應(yīng)，阻止肝組織進(jìn)一步損傷，主要分泌IL-10、TGF-β、IL-35等細(xì)胞因子[2,3]。Th17/Treg比例失衡可能是CHB發(fā)病機(jī)制中另一重要因素[4,5]。IL-21是近年發(fā)現(xiàn)的γc家族細(xì)胞因子成員之一，主要由Th17及TFH細(xì)胞產(chǎn)生[6]。 IL-21可影響Th17及Treg細(xì)胞的產(chǎn)生，可通過干擾foxp3表達(dá)而抑制Treg細(xì)胞產(chǎn)生，同時通過自分泌途徑誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的發(fā)育。本研究分析IL-21在Th17/Treg失衡中的作用。

資料和方法

一、研究對象

徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染性疾病科2012年7月到2012年12月住院及肝炎門診59例CHB患者，男37例，女22例，年齡(28.5±10.3)歲。ALT為(206±84)U/L，HBsAg為(3.53±0.62) lg IU/mL，HBV DNA為(7.03±0.84) lg IU/mL。診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2010年中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會和感染病學(xué)分會聯(lián)合制定的《慢性乙型肝炎防治指南》，排除合并其他肝炎病毒感染、自身免疫性肝炎、藥物性肝病、酒精性肝病、肝炎肝硬化等疾病。25名健康對照者來自徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院健康體檢中心，男17名，女8名，年齡(27.0±8.7)歲。

二、流式細(xì)胞儀檢測外周血中Th17、Treg細(xì)胞

取上述研究對象外周新鮮無菌肝素抗凝血和RPMI 1640培養(yǎng)液各100 μL混勻，分別加入5 μL 佛波醇酯(2 μg/mL)、5 μL離子霉素 (50 μg/mL)和4 μL布雷菲德菌素(0.5 mg/mL)。 在37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)5 h, 取出細(xì)胞。流式試管中分別加入PerCP-Cy5.5 抗-人 CD3單抗和FITC 抗-人 CD8單抗各5 μL，再加入100 μL經(jīng)刺激培養(yǎng)的全血細(xì)胞，混勻后室溫避光孵育20 min，加入固定劑100 μL，室溫避光反應(yīng)10 min，PBS洗滌細(xì)胞1次，離心5 min，棄上清液。再加入破膜劑100 μL ，同時加入 PE 抗-人 IL-17A 單抗或者同型對照抗體5 μL，混勻后室溫避光孵育15 min，PBS洗滌，離心后，棄上清。 加入200 μL PBS，上機(jī)檢測，分析CD3+CD8-IL-17A+細(xì)胞即為Th17細(xì)胞頻數(shù)。為檢測Treg細(xì)胞，另取100 μL肝素化外周新鮮全血加入流式試管中，后加入FITC 抗-人 CD4、PE 抗-人 CD25、AF647 抗-人 CD127各5 μL，充分混勻后，室溫避光孵育30 min。加入2 mL紅細(xì)胞裂解液，室溫暗處孵育10 min。室溫1200 r/min，離心5 min，并棄去上清。加入3 mL PBS洗滌液，混勻，1200 r/min，離心5 min，并棄去上清。加入300 μL PBS洗滌液重懸細(xì)胞后流式細(xì)胞儀檢測。以上流式抗體均為美國eBioscience公司產(chǎn)品。

三、外周淋巴細(xì)胞分離和細(xì)胞培養(yǎng)

取CHB患者外周抗凝靜脈血5 mL，取等體積的淋巴分離液加入無菌離心管中，將血液沿管壁加入淋巴細(xì)胞分離液上層，2 000 r/min離心20 min；取中間白膜層，加入適量PBS液洗滌1～2次。用含10%胎牛血清RBMl 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。將重懸細(xì)胞分成3組，IL-2組、IL-21組及PBS對照組，培養(yǎng)48 h后,分別收集培養(yǎng)上清及細(xì)胞備檢測。

四、細(xì)胞因子檢測

收集研究對象外周血清和上述細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用ELISA法測定IL-21、IL-17、IL-10及TGF-β水平。IL-21、IL-17、IL-10及TGF-β ELISA檢測試劑盒均購自美國R&D公司。

五、RORγt和Foxp3 mRNA表達(dá)水平測定

用Trizol法抽提收集培養(yǎng)細(xì)胞總RNA，加入適量的無核酶水將RNA稀釋為1 μg/μL。根據(jù)GenBank中人RORγt及Foxp3基因序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計出引物：RORγt正向引物5′- AGATACC-CTCACCTACACCTTG -3′，反向引物5′-CCGCTC-AGGGCTGTATTCAA-3′；Foxp3正向引物5′- TGACCAAGGCTTCATCTGTG -3′，反向引物5′- GAACTCTGGGAATGTGCTGTT -3′；GAPDH作為內(nèi)參對照，正向引物5′- GGGAAACTGTGGCGT-GAT - 3′，反向引物5′- GAGTGGGTGTCGCTGTT-GA -3′。反轉(zhuǎn)錄條件按照試劑盒說明書進(jìn)行，取2 μL得到的cDNA模板進(jìn)行檢測，操作方法參考實時PCR試劑盒說明書，反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min預(yù)變性，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個循環(huán)。熔解曲線設(shè)定95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)實時PCR擴(kuò)增曲線和熔解曲線以及分析擴(kuò)增基因表達(dá)情況。RORγt及Foxp3 mRNA相對表達(dá)量用2-ΔΔCt表示。

六、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié)果

一、CHB患者外周血Th17、Treg細(xì)胞頻數(shù)及Th17/Treg的比值

采用流式細(xì)胞儀測定外周血中Th17、Treg細(xì)胞頻數(shù)，結(jié)果如圖1所示，與健康對照(1.62±0.71)%相比，CHB患者外周血中Th17頻數(shù)(2.69±1.44)%顯著升高，而Treg頻數(shù)無顯著差異；CHB患者中Th17/Treg比值顯著高于健康對照。

二、CHB患者外周血清IL-21水平與Th17/Treg相關(guān)關(guān)系

相關(guān)關(guān)系分析表明，CHB患者外周血清IL-21濃度分別與外周血Th17/Treg細(xì)胞呈正相關(guān)(r=0.380，P=0.008)，見圖2，而IL-10、IL-17、TGF-β水平與Th17/Treg比例無明顯相關(guān)性。

注：1A.Th17細(xì)胞流式圖；1B.Treg細(xì)胞流式圖

圖2　CHB患者外周血中Th17/Treg與IL-21水平關(guān)系

三、CHB患者外周血清IL-21、IL-17、IL-10及TGF-β水平

CHB組血清IL-21為(42.34±34.78) pg/mL、IL-17為(26.60±37.97) pg/mL、TGF-β為(24 726±11 235.81) pg/mL，均明顯高于健康對照組的(17.1±11.09)、(7.71±7.62) pg/mL(P=0.002)和(18 249.03±7 603.58) pg/mL(P=0.030)。CHB組血

清IL-10(34.12±33.32) pg/mL高于健康對照組的(25.94±27.01) pg/mL，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

四、CHB患者的IL-21對PBMC 中RORγt mRNA、Foxp3 mRNA表達(dá)的影響

與IL-2和PBS相比，CHB患者的IL-21使RORγt mRNA表達(dá)水平顯著升高，而Foxp3 mRNA表達(dá)水平顯著降低。見圖3。

五、CHB患者的IL-21對PBMC 生成細(xì)胞因子IL-17、TGF-β及IL-10的影響

各試驗組PBMC培養(yǎng)上清中IL-17水平，與IL-2組(16.60±6.00) pg/mL和PBS組(10.61±6.09) pg/mL相比，IL-21組IL-17(41.24±20.36) pg/mL水平顯著升高(P=0.049，P=0.018)；與IL-2組IL-10 (161.97±65.16) pg/mL或TGF-β(8 979.20±1 580.19) pg/mL相比，IL-21組IL-10(58.75±45.62) pg/mL或TGF-β(6 763.40±921.57)水平顯著下降(P=0.017，P=0.040)。見圖4。

圖3　CHB患者的IL-21對PBMC中RORγmRNA和FOXp3mRNA表達(dá)的影響

圖4　CHB患者的IL-21對PBMC產(chǎn)生IL-10、IL-17及TGF-β水平的影響

討論

介導(dǎo)免疫耐受的Treg細(xì)胞和介導(dǎo)炎性反應(yīng)的Th17細(xì)胞之間功能和分化過程相互對抗，正常狀態(tài)下兩者保持平衡，如果Th17/Treg失衡，將引起全身或局部免疫應(yīng)答異常。與已報道的研究結(jié)果一致[4,5,7]，本研究結(jié)果顯示，CHB患者Th17/Treg比例顯著高于正常人群水平，出現(xiàn)失衡狀態(tài)。提示與Treg相比，CHB患者處于一種Th17細(xì)胞增多并趨于優(yōu)勢地位的炎性狀態(tài)，這可能是導(dǎo)致肝臟炎性反應(yīng)的重要因素。

細(xì)胞因子在CD4+T淋巴細(xì)胞向Treg、Th17細(xì)胞分化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，TGF-β能促進(jìn)Treg細(xì)胞分化，分泌IL-10、TGF-β及FoxP3表達(dá)，而在TGF-β、IL-6及IL-21作用下則促進(jìn)Th17細(xì)胞分化、生成，進(jìn)而分泌IL-17、IL-23及IL-21等細(xì)胞因子[8]。

IL-21是初始CD4+T淋巴細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化和發(fā)育過程中必要的細(xì)胞因子，同時還可以通過自分泌促進(jìn)Th17的發(fā)育[9]。研究表明，CHB狀態(tài)下IL-21對HBV感染發(fā)揮免疫控制的作用，IL-21可以通過維持HBV特異性CTL細(xì)胞功能及促進(jìn)HBV特異性體液免疫功能控制HBV感染[10-11]。同時，外周血IL-21水平與CHB疾病進(jìn)展特別是重癥肝炎病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)[12-14]。本研究結(jié)果顯示CHB患者外周血IL-21、IL-17、TGF-β水平明顯高于正常人群，并且IL-21與Th17/Treg顯著正相關(guān)，提示IL-21不僅是重要的炎性因子，還可能是TH17/Treg比例失調(diào)的重要原因。

鑒于IL-21對Th17及Treg的分化及發(fā)育過程均有影響，為進(jìn)一步研究IL-21在CHB患者中Th17/Treg失衡中的作用，以IL-21體外刺激CHB患者PBMCs,并對Th17、Treg各自特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt和Foxp3的mRNA水平進(jìn)行定量檢測，結(jié)果顯示IL-21能顯著促進(jìn)RORγt mRNA表達(dá)而降低Foxp3 mRNA表達(dá)水平，相對應(yīng)培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的檢測中發(fā)現(xiàn)，與IL-2相比，IL-21能促進(jìn)IL-17表達(dá)而降低IL-10及TGF-β水平；提示Il-21能通過促進(jìn)RORγt mRNA表達(dá)及抑制Foxp3 mRNA表達(dá)調(diào)控Th17/Treg，從而導(dǎo)致Th17與Treg細(xì)胞比例失衡。

綜上分析，本研究在發(fā)現(xiàn)CHB患者存在Th17/Treg失衡的基礎(chǔ)上，通過體外試驗證實了IL-21能促進(jìn)CHB患者外周血Th17細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達(dá)，提高了Th17細(xì)胞的活性，同時抑制了Treg細(xì)胞的分化，在CHB發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，這為今后通過調(diào)控Th17/Treg失衡進(jìn)而延緩CHB病情進(jìn)展的治療提供了理論和實驗依據(jù)。

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(本文編輯：錢燕)

The role of interleukin-21 in Th17/Treg imbalance in patients with chronic hepatitis B

GENGJian,LIURui-xia,GAOXi-yang,LIYan,PANXiu-cheng,FUJuan-juan,LILi.DepartmentofInfectiousDisease,AffiliatedHospitalofXuzhouMedicalColleague，Jiangsu221002，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the role of interleukin-21 in T helper cell 17 (Th17)/regulatory T cells (Treg) imbalance in chronic hepatitis B (CHB) patients, and its mechanism. MethodsFrequencies of Th17 cells and Treg in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of 76 CHB patients and 20 health controls were detected by flow cytometry, and serum levels of interleukin (IL)-21, IL-17, transforming growth factor (TGF)-β and IL-10 were measured by enzyme-linked immune-sorbent assay (ELISA). Under stimulation of IL-21 or IL-2 in vitro, levels of RORγt and Foxp3 mRNA in PBMCs were detected by real time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), and levels of IL-17, IL-10, TGF-β in supernatants were determined by ELISA assay, respectively. ResultsThe level of IL-21 was positively associated with the ratio of Th17 to Treg, which was significantly enhanced in CHB patients when compared with that in health controls (P<0.05). In IL-21 stimulated PBMCs of CHB patients, the expression of RORγt mRNA was significantly increased (P=0.016), while the expression of Foxp3 mRNA was obviously decreased (P=0.018), comparing with those in IL-2 stimulation group. Additionally, level of IL-17 in the corresponding supernatants was notably enhanced (P=0.049), while levels of IL-10 and TGF-β were decreased significantly (P=0.017, P=0.004), respectively. Conclusion IL-21 could enhance the ratio of Th17 to Treg through increasing the expression of RORγt mRNA and decreasing the expression of Foxp3 mRNA in patients with CHB.

【Key words】Interleukin-21; Chronic hepatitis B; Th17 cell; Regulatory T cell

(收稿日期：2015-11-04)

Corresponding author:PAN Xiu-cheng, Email: xzpxc68@126.com

通信作者：潘修成，Email：xzpxc68@126.com

基金項目：江蘇省臨床醫(yī)學(xué)科技專項 (BL2012043)