黃戎娟　劉洋　張聰

400038　中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學實驗動物中心

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建立大鼠原位肝移植模型的手術(shù)技巧

黃戎娟劉洋張聰

400038中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學實驗動物中心

【摘要】目的采用“二袖套法”建立穩(wěn)定的大鼠原位肝移植模型，為臨床試驗提供依據(jù)，并探討手術(shù)技巧。方法在Kamada的“二袖套法”基礎(chǔ)上進一步改進，供體經(jīng)腹主動脈行肝臟冷灌注，用縫合法吻合肝上下腔靜脈, 用袖套法吻合門靜脈與肝下腔靜脈, 膽道采用支架法重建。對200只SD大鼠進行原位肝移植，記錄各項操作時間以及術(shù)后存活率、并發(fā)癥情況，專人對數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。結(jié)果共對200只大鼠采用改良的“二袖套法”行原位肝移植。手術(shù)成功率為90.00%(180/200)。部分大鼠死亡原因包括出血、肝下腔靜脈血栓、肝上下腔靜脈回流不暢、袖套扭轉(zhuǎn)、脫落、膽瘺、膽道梗阻、肝功能衰竭以及肝膿腫。結(jié)論能熟練進行顯微外科操作，并且手術(shù)精確是縮短操作過程以及減少術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生的前提。而受體大鼠的術(shù)后存活情況又與無肝期時間密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】肝移植；模型；并發(fā)癥；顯微外科術(shù)

近年，醫(yī)治終末期肝病的唯一辦法就是進行肝移植手術(shù)。隨著需要行肝移植患者數(shù)目的持續(xù)增長與供肝數(shù)量缺少越加明顯的沖突，霹裂式肝移植與活體肝移植的產(chǎn)生成功地緩解了這一沖突[1]。但是此類肝移植,尤其是活體肝移植,出于對供體的安全性考慮,被移植的供肝可能與受體會出現(xiàn)重量或體積不匹配的情況,從而導致小體積綜合征(SFSS)[2]。大鼠原位肝移植模型作為深入研究小體積綜合征的重要模型，可用在研究肝臟的缺血再灌注損傷、移植排斥反應、原位肝臟移植中器官的保存和免疫耐受機制等各個方面的問題，已經(jīng)被國內(nèi)外移植中心廣泛接納并進行大量改進。在建立模型的初期，動物存活的概率極低，直至使用了Kamada等[3]創(chuàng)建的“二袖套法”，才大大提高了大鼠術(shù)后的存活率。但是，就手術(shù)本身操作來說，難度較大。本研究通過采用“二袖套法”對 200只大鼠進行原位肝移植，對肝移植術(shù)操作的方法以及預防并發(fā)癥的發(fā)生等問題進行分析討論，希望能構(gòu)建穩(wěn)定、可靠的大鼠原位肝移植模型。

資料和方法

一、材料

200只六周齡的雄性清潔級SD大鼠(購于第三軍醫(yī)大學實驗動物中心)。大鼠于清潔級飼養(yǎng)室喂養(yǎng)2周,飼養(yǎng)條件符合SPF標準。待體質(zhì)量增至200～300 g時配為供受體。受體(相差約為10 g)的體質(zhì)量稍稍比供體的重些，手術(shù)前一晚禁食不禁水。單人操作MC-M900型手術(shù)顯微鏡進行操作，并采用乙醚持續(xù)開放麻醉以及相對無菌技術(shù)。

二、手術(shù)方法

(一)獲取供肝吸進乙醚持續(xù)麻醉之后，取大鼠仰臥位，腹部正中切口,逐層進行分離，隨后進入腹腔。棉簽浸濕后鈍性分離，用鹽水小紗布輔助暴露，注意操作輕柔謹慎。按逆時針的方向?qū)⒏闻K周圍韌帶逐一分離,先后斷開左三角韌帶和肝鐮狀韌帶,將左膈靜脈以及肝和食管之間血管交通支結(jié)扎并斷開。隨后暴露肝門,游離出膽總管,把前壁剪開, 把硬膜外導管制成的膽囊內(nèi)支撐管從切口向近端插入,再用5-0絲線把膽總管固定于支架管的淺槽里。將門靜脈游離。將幽門靜脈斷離。一般情況下，不需要結(jié)扎脾靜脈,以防止吻合的時候過長或者扭曲。把250 IU肝素的生理鹽水通過陰莖背靜脈注入,肝素化供體大鼠的血液。在近腔靜脈處把右腎上腺靜脈進行結(jié)扎并切斷。向左側(cè)移動腸管,暴露左腎靜脈水平以下的腹主動脈，并向近心端穿刺其前壁,置入導管以灌注。之后剪開膈肌,把胸主動脈用鉗夾剪斷。將0℃～4℃的10 mL乳酸林格氏液通過腹主動脈導管注入,同時迅速把膈上下腔靜脈切斷,引流出灌注液,并不斷地用4℃的乳酸林格氏液澆淋供肝表面,讓供肝均勻降溫。最后貼住膈肌環(huán)將肝上下腔靜脈斷開。把肝動脈結(jié)扎、切斷,于門靜脈與脾靜脈匯合處將門靜脈斷離,在左腎靜脈的上方把肝下腔靜脈斷離。獲取供肝，保存在4℃保存液里。

(二)修整供體肝操作在4℃乳酸林格氏液中進行。由14號與16號聚乙烯靜脈穿刺套管針的套管制作而成的門靜脈與肝下腔靜脈套管。把外翻的門靜脈與肝下腔靜脈套于血管套管后并固定。配備血管袖口時，一定要確保套管安裝在正確的位置上。在修正的時候，要不斷修剪肝上、下腔靜脈旁的膈肌，并剪去其腔靜脈環(huán)水平多余的下腔靜脈。

(三)受體肝切除手術(shù)之前，受體肌肉注射0.03 mg的阿托品和抗生素。麻醉的方法、手術(shù)的體位、切口與供體一致。但是在固定四肢時，為防止針頭刺傷肢體，需借助橡皮筋。按逆時針方向逐個游離肝周韌帶。結(jié)扎肝固有動脈的起始部，并從近肝端將肝固有動脈切斷。斜形剪開膽總管在左右肝管匯合之處，在遠端放入臨時使用的膽管內(nèi)支撐管，擴張備用，并用絲線結(jié)環(huán)扎固定。把后腹膜剪開，腎血管的平面上的肝下腔靜脈后面使用顯微鑷游離,同時結(jié)扎右腎上腺靜脈。注意保護被結(jié)扎的右腎上腺靜脈不被斷離，以作為受體即將要切斷的肝下腔靜脈固定的支撐點。使用血管夾按照肝下腔靜脈(臨近右腎靜脈)、門靜脈(臨近幽門靜脈)依次夾閉，確保受體進入無肝期。降低吸入麻醉的劑量。在門靜脈的分叉處用5號針頭穿刺，隨后注入2 mL的生理鹽水，待肝臟轉(zhuǎn)為土黃色。使用膈肌鉗和小兒Satinsky鉗將肝上下腔靜脈鉗夾，并緊貼著肝臟斷離。再在門靜脈分叉處剪斷門靜脈。最后上提肝臟，將肝下腔靜脈斷離，并且注意留少量肝組織以確保下腔靜脈斷端保持張開狀態(tài)。移出受體肝臟。

(四)原位肝移植把供肝放在原來的位置，將小紗布墊置在肝后，調(diào)整紗布，把供肝與受體的相應血管調(diào)整到最吻合的位置。用彎頭顯微持針鉗和8-0血管縫線連續(xù)縫合供肝與受體的肝上下腔靜脈。把門靜脈上的套管柄用顯微止血鉗鉗夾,并用膠泥固定后者。將膠泥位置和血管鉗方向謹慎調(diào)整后，確保供肝門靜脈套管與受體的門靜脈距離最小，將后者套于套管，采用絲線固定。隨后松開受體的靜脈阻斷夾，待肝臟迅速變紅后，松開Satinsky鉗，結(jié)束無肝期。用膠泥輔助固定,采用相同方法吻合肝下腔靜脈?？梢娪夷I的外觀很快變?yōu)檎?，否則，則提示下腔靜脈可能回流受阻。將用于固定受體膽總管支撐管插管的絲線活結(jié)打開，拔出膽總管內(nèi)的支撐管，清洗其切口處的血凝塊，并把供肝的膽總管里支撐管外側(cè)的1/2插進受體的膽總管。因為需要重新建立膽管血供并避免膽漏，應把大網(wǎng)膜圍繞在吻合口。最后逐一關(guān)腹。

三、術(shù)后護理

手術(shù)后緩慢注射2 mL乳酸林格氏液于陰莖背靜脈以補充血容量，糾正酸中毒。把大鼠放在保溫燈下進行照射并讓其連續(xù)吸入氧氣，等其完整清醒并可以照?；顒雍?，置入單籠喂養(yǎng)1 d，當日飲用10%葡萄糖。次日標記后與其它動物合籠，正常飲食。若要采血檢查，則需進行采血后補液。

結(jié)果

一、各項操作時間統(tǒng)計

本研究采取改良后的“二袖套法”行手術(shù)200次。其中獲取供肝的手術(shù)時間(29.52±5.34) min；修整供肝時間(11.31±3.37) min；受體操作時間(包括肝切除和原位肝移植)共(44.24±5.54) min，無肝期(18.45±2.59) min。

二、并發(fā)癥情況與存活率

術(shù)后2 d內(nèi)共死亡20例，其中8例因出血，6例因肝下腔靜脈血栓，4例因肝上下腔靜脈回流不暢，2例因袖套扭轉(zhuǎn)、脫落。手術(shù)成功率(術(shù)后2 d存活率)為90.00%(180/200)。術(shù)后1周內(nèi)共死亡41例，除去前2 d內(nèi)死亡者，1例因肝下腔靜脈血栓，1例因肝上、下腔靜脈回流不暢，4例因膽漏,6例因膽道梗阻，8例因肝功能衰竭，1例因肝膿腫。1周存活率為79.50%(159/200)。3個月內(nèi)共死亡56例，除去前1周內(nèi)死亡者，11例因膽道梗阻，3例因肝功能衰竭，1例因肝膿腫。3個月存活率為72.00%(144/200)。至發(fā)文時，術(shù)后存活時間最長的大鼠已超過16個月。詳見表1。

表1　各階段大鼠死亡原因及存活率情況

討論

一、手術(shù)操作技巧

供體與受體在手術(shù)前1晚不需禁食,不過，在手術(shù)前受體需要肌注0.03 mg的阿托品，用于減少呼吸道產(chǎn)生過多分泌物以及預防窒息等。

供體與受體都采取在腹部正中切口的方法，可以防止在操作橫切口的時候出血過多，另外還有手術(shù)創(chuàng)傷小、恢復得快等優(yōu)點[4]。在供體與受體肝臟游離時，都按逆時針方向逐步分離，可避免因多次翻動肝臟而造成刺激，同時規(guī)范了操作的步驟也節(jié)省了時間。在受體進行分離肝臟手術(shù)時，肝上、下腔靜脈的后方要預留牽引線，便于鉗夾與分離肝上、下腔靜脈的時候?qū)⒏闻K牽引向下。

供體經(jīng)腹主動脈行肝臟冷灌注。游離供肝后，通過用乳酸林格氏液(含肝素100 U)10 mL經(jīng)腹主動脈進行肝臟冷灌注，外加4℃的乳酸林格氏液澆淋供肝表面，以使供肝盡快進入冷缺血狀態(tài)。進入腹主動脈之后的灌注液，大多數(shù)通過各器官循環(huán)進到門靜脈，最后灌注肝臟，小部分則通過肝動脈立刻灌注到肝臟,既使肝臟有了雙重灌注，也能確保門靜脈適當壓力，保證得到的供肝熱缺血時間靠近零，且質(zhì)量較好[5]。 Kashfi A等[6]研究發(fā)現(xiàn)，跟以往的經(jīng)門靜脈灌注后行肝臟冷灌注相比，經(jīng)腹主動脈灌洗具有更均勻和徹底等諸多優(yōu)點。此外，研究發(fā)現(xiàn)肝素化供體血液比單純經(jīng)陰莖背靜脈注射純肝素250 IU的效果好，且便于移植肝在復流后的微循環(huán)恢復。

修整供肝時，要使用溫度處在4℃的保存液。進行套血管袖口時，右腎靜脈結(jié)扎線與門靜脈屬支的結(jié)扎線可用作辨別血管方向的標記，確保套管柄在肝下腔靜脈與門靜脈前方[5]。把套管體部里血管的旁邊清除整潔，防止留在脂肪組織或者結(jié)扎線頭。部分研究提出在修剪肝上、下腔靜脈的時候留下少許膈肌，防止縫合血管時產(chǎn)生撕裂現(xiàn)象[7]。但我們發(fā)現(xiàn)，在手中修剪肝所有膈肌后，由于無膈肌的存在，血管的可塑性會變得更好，還確保吻合口的大小足夠，只要小心操作，就不會造成血管撕裂。

在血管重新建立的過程中，本研究全部采用“二袖套法”吻合血管，即將肝下腔靜脈與門靜脈以袖套法吻合，而肝臟上、下腔靜脈則以縫合法吻合，結(jié)果令人滿意。同時，還可通過移動膠泥的位置與使用輔助小紗布來調(diào)整供體與受體之間的血管處于最佳吻合位置。研究人員發(fā)現(xiàn)[8]，受體的無肝期不應該超過26 min。而本組無肝期為(18.45±2.59) min，雖然有6例大鼠的無肝期長達30 min,術(shù)后3個月內(nèi)仍有4例移植成活。但我們也認為受體大鼠的無肝期長短是手術(shù)是否成功的關(guān)鍵。另外，在吻合肝上、下腔靜脈時，因為其壁薄,操作應輕柔細致,爭取一次成功。

二、術(shù)后并發(fā)癥的預防

出血：本組共有8例動物由于術(shù)后出血死亡，通過尸檢發(fā)現(xiàn)部分是因兩拐角處縫合不牢靠造成,部分則因為縫合時進針緣距過大，導致靜脈壁因受力不均而撕裂。因此，熟練地運用顯微縫合技術(shù)，縫合過程中小心謹慎，并確保吻合口無張力是預防術(shù)后出血的重要之處。而靜脈縫合后不需要再檢查吻合口，以免撕裂靜脈[9]。

血栓形成：本組共發(fā)生肝下腔靜脈血栓7例。研究表明，肝下腔靜脈血栓常發(fā)生于術(shù)后早期，根據(jù)經(jīng)驗，在進行血管重建時，應僅用顯微鑷夾血管外膜，而盡可能避免損傷血管內(nèi)皮。在吻合之前，放出部分受體大鼠血管里近心端淤阻的高凝血液與血凝塊。此外，盡可能縮短受體操作的手術(shù)時間也是預防本并發(fā)癥的關(guān)鍵。

膽道梗阻：與血栓不同，膽道梗阻多發(fā)生在術(shù)后晚期,且對受體大鼠肝原位肝移植后長期存活的影響很大。本組共發(fā)生膽道梗阻17例，尸檢可見，膽道插管被泥沙樣的結(jié)石堵塞，管長多長于5 mm。這提示可能因插管過長導致膽汁流出不暢，加上插管時容易損傷膽管內(nèi)壁引發(fā)炎癥，最終形成結(jié)石堵塞膽管。因此管長不應過長，直徑要和膽總管的直徑相匹配，同時還要防止因鉗夾使膽管變形，并在插入膽管前沖洗管內(nèi)血液。

綜上所述，許多因素都能夠?qū)υ桓我浦材Ｐ痛婊町a(chǎn)生影響，因此，必須重視操作中所有細節(jié)。能熟練進行顯微外科操作，并且手術(shù)精確是縮短操作過程以及減少術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生的前提。而受體大鼠的術(shù)后存活情況又與無肝期時間密切相關(guān)。細致耐心的操作與反復訓練則是肝移植成功的關(guān)鍵所在。而良好的麻醉控制，穩(wěn)定的血液動力學，以及移植后立刻恢復體溫、保持呼吸道通暢等也能夠讓手術(shù)成功率大大提高。

參考文獻

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(本文編輯：易玲)

(收稿日期：2015-08-10)