張穎

江蘇省中醫(yī)院 江蘇南京 210029

高效液相色譜法測定健腦補腎丸中連翹苷的含量

張穎

江蘇省中醫(yī)院 江蘇南京 210029

目的：采用高效液相法測定健腦補腎丸中連翹苷的含量。方法：采用 Agilent C18（150×4.6mm，5μm）色譜柱，以乙腈-水(25：75)為流動相，流速1.0 mL·min-1，檢測波長277nm，柱溫25℃。結(jié)果：連翹苷濃度在20.0～100.0μg·mL-1范圍內(nèi)，與峰面積呈良好線性關系；平均加樣回收率為98.04%，RSD為0.85%。結(jié)論：該方法簡便、準確、重復性好，可作為健腦補腎丸質(zhì)量控制方法。

高效液相色譜法；健腦補腎丸；連翹苷；含量測定；質(zhì)量控制

健腦補腎丸是由人參、鹿茸、狗鞭、肉桂、連翹、金櫻子、杜仲（炭）、當歸等25味藥材提煉制成，具有健腦補腎，益氣健脾，安神定志等功效。連翹苷是連翹中的重要有效成分之一，為木脂類化合物，在抗炎解熱方面具有突出作用[1]。目前，對于健腦補腎丸的質(zhì)量研究多集中于芍藥苷和綠原酸等成分的含量測定，未見對連翹苷成分的含量測定的相關文獻報道[2]。健腦補腎丸成分復雜,現(xiàn)行質(zhì)量標準過于簡單,不夠完善。本實驗建立了高效液相色譜法測定其中連翹苷的含量，方法簡便快速，對于健腦補腎丸的質(zhì)量控制具有一定意義。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

美國Waters 2695 高效液相色譜儀（Waters 2996 PDA檢測器，Empower 色譜工作站），十萬分之一電子天平（Mettler Toledo 公司），DQHZ-2001A恒溫振蕩器（江蘇太倉華美生化儀器廠），DGG-9053A超聲波清洗器（常州國華電器有限公司）。

1.2 試藥

健腦補腎丸（山東臨清華威藥業(yè)有限），對照品連翹苷（中國藥品與生物制品檢定研究院），甲醇為色譜純（江蘇漢邦科技有限公司），無水乙醇（AR，江蘇彤晟化學試劑有限公司），中性氧化鋁（國藥集團化學試劑有限公司），超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 測定方法 照高效液相色譜法（通則0512測定）。[3-5]

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 采用Agilent C18（150mm×4.6mm，5μm ）色譜柱，以乙腈－水(25：75) 為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為277nm，柱溫為25℃，進樣量為20μL，采集時間為60 min。理論板數(shù)按連翹苷峰計算應不低于 5000，連翹苷峰與相鄰峰的分離度應符合要求。

對照品溶液的制備 精密稱取連翹苷對照品 10.00mg，加甲醇制成0.10mg·mL-1連翹苷對照品溶液，即得。

供試品溶液的制備 取健腦補腎丸樣品適量，于研缽中研細，精密稱取研細后的粉末1g，精密加入甲醇15mL，至具塞錐形瓶中，密塞，稱定其重量，記錄數(shù)據(jù)，放置12h。超聲處理25min，放冷至室溫，補足失重，濾過。精密吸取續(xù)濾液 5mL，于蒸發(fā)皿中水浴蒸至約0.5mL，加中性氧化鋁粉末0.5g拌樣后，蒸干，加于處理好的中性氧化鋁柱（100～200目，1.5g，內(nèi)徑15mm）上，用75%乙醇60mL洗脫，收集洗脫液，置水浴上再次蒸干，用 50%甲醇溶解，并轉(zhuǎn)入5mL量瓶中，定容到刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜過濾，取濾液作為供試品溶液。

測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各 10μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.2 方法驗證

2.2.1 連翹苷的定性

分別取供試品溶液和對照品溶液，按2.1 色譜條件，進行色譜圖采集。實驗結(jié)果表明，供試品溶液中主峰的色譜保留時間與連翹苷對照品的保留時間一致。

2.2.2 線性關系

精密量取對照品溶液適量，分別制成濃度為20.0、40.0、60.0 、80.0、100.0μg/mL的溶液，按2.1色譜條件進行進樣分析，記錄色譜圖。以對照品溶液濃度為橫坐標X，測得的峰面積為縱坐標Y，進行線性回歸，得回歸方程為Y=8875.7X+13970,R2=0.9994,結(jié)果表明，連翹苷在20.0～100.0μg/ml范圍內(nèi)線性關系良好。

2.2.3 精密度試驗

按2.1色譜條件，取同一對照品溶液（60.0μg/mL），連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，以連翹苷峰面積計算，RSD(n=6) 為 0.31%。結(jié)果表明精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、16、24 h，按2.1項色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。連翹苷峰面積的 RSD 為0.13%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 重復性試驗

取同一批次樣品，按2.1項色譜條件平行測定6次，記錄色譜圖，計算連翹苷的含量。結(jié)果含量為 0.9076mg/g，RSD=1.5%，表明方法重復性良好。

2.5.5 回收率試驗

取已知含量的樣品（0.9076mg/g）9份，每份0.5g，分別加入濃度為4.0、6.0、8.0 mg/mL連翹苷對照品溶液各1ml，每個濃度組平行3份，混勻，制成低、中、高3種濃度的待測溶液，按前述實驗方法和條件，分別測定，計算回收率，結(jié)果見表1。由此可見，低、中、高 3種濃度的回收率均在 96.56%～99.07%之間，平均回收率為98.04%，RSD為0.85%。表明本定量分析的測定結(jié)果準確性較高。

表1 回收率計算表

圖1 連翹苷對照品

圖2 供試品溶液色譜圖

2.5.6 含量測定

分別取 3個批號的健腦補腎丸，每個樣品取 2 份，按2.1項下方法測定，結(jié)果見表2。

表2 健腦補腎丸中連翹苷的含量 （n=2）

3 討論

3.1 波長的選擇參考有關文獻[6-8]發(fā)現(xiàn)測定連翹苷含量的研究大多使用 280nm和277nm波長，極少的研究中使用205nm或228nm的波長。通過實驗比較，采用 277nm的色譜圖基線更加平穩(wěn)，檢出結(jié)果中有干擾作用的的雜質(zhì)峰少，故選擇277 nm作為檢測波長。

3.2 流動相的選擇

分別考察了乙腈-水系統(tǒng)和乙腈-0.5%磷酸系統(tǒng)作為流動相，實驗結(jié)果顯示，以乙腈－水系統(tǒng)為流動相，所得色譜峰峰形好，分離效果佳，故選擇乙腈-水作為流動相。

3.3 提取工藝的考察

在條件摸索過程中，我們根據(jù)資料查閱[9]嘗試過多中提取方法，其中具有對比價值的實驗方法為：取本品細粉適量，置于 70℃烘箱中干燥18個小時，精密稱定2.0g,置索氏提取器中，加入適量甲醇，水浴回流至提取液無色（約6h），回收甲醇至近干，加中性氧化鋁0.5g拌樣后，蒸干，加于處理好的中性氧化鋁柱（100～200目，1.5g，內(nèi)徑15mm）上，用75%乙醇60ml洗脫，收集洗脫液，置水浴上蒸干，用50%甲醇溶解，并轉(zhuǎn)入10ml量瓶中，定容到刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，濾液作為供試品溶液。但是由于該處理方法耗時長，過程繁瑣，故最終采用本實驗的提取方法。

本實驗最終確立了高效液相色譜法測定健腦補腎丸中連翹苷含量，該方法穩(wěn)定性高，重復性好，分離效果好，樣品易處理，為健腦補腎丸的質(zhì)量控制提供了更為全面的研究依據(jù)。

[1]張萌，富志軍，林以寧.連翹有效成分的吸收與代謝研究進展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2013，9(5):58-61

[2]靳維榮，高國敬，藤建北.高效液相色譜法測定健腦補腎丸中綠原酸的含量[J].時珍國醫(yī)國藥，2006，17(2)：195-196

[3]中華人民共和國藥典2015年版（一部）[s]，北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015:170-171.

[4]潘酷，張輝，宋文靜.HPLC法測定清熱膠囊中連翹苷的含量[J].天津藥學，2016，28（2）：16-17.

[5]鄒曉華，何偉康，戴安印等.高效液相色譜法測定感冒熱毒清合劑中連翹苷的含量[J].中國醫(yī)藥導報，2015，12（15）：117-119，123.

[6]徐秀珍，栗曉黎.高效液相色譜法測定連翹中連翹苷的含量[J].藥物分析雜志，1998，18(3):203-204.

[7]王偉芳，徐綏緒，張國剛.用兩種高效液相色譜法測定連翹中連翹苷的含量[J].沈陽藥科大學學報，1999，16(4):265-269.

[8]韓桂茹，龐國勛.連翹苷檢測波長的研究[J].中國藥品標準，2005，6(3):71-73

[9]韓莉，張貞麗，徐麗華，袁敏.連翹中連翹苷含量測定方法的試驗研究[J].齊魯藥事,2008，27（3): 153-154.

R421.3+81

A

1672-5018（2016）12-030-02