王曉雙 黃韜 秦力悅 李鴻麗 蘭云意 吳輝 張蓓蓓 石海蓮 吳曉俊 王崢濤

[摘要]該研究旨在探討越南人參皂苷R7（R7）對LPS及TNFα聯(lián)合誘導下大鼠星形膠質細胞C6的激活抑制作用及機制。取對數(shù)生長的C6細胞，在無血清的DMEM培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)24 h后，使用025%胰酶將其消化收集，按15×106個/mL密度接入培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜。實驗分組如下：對照組（無藥物處理），模型組（LPS 1 mg·L-1，TNFα 10 μg·L-1處理24 h），給藥組（分別用625，125，25，50，75 μmol·L-1 R7， 4 μmol·L-1 LNMMA預處理2 h后，再經(jīng)過LPS 1 mg·L-1，TNFα 10 μg·L-1刺激24 h）。處理之后，CCK8法檢測細胞活力，Griess法檢測培養(yǎng)基中NO含量，ELISA法檢測培養(yǎng)基中IL6，TNFα濃度，實時定量PCR法檢測細胞中相關炎癥基因的表達，雙熒光素酶報告基因法檢測細胞中NFκB信號分子的激活。研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相對比，R7量效相關性降低C6細胞的NO釋放水平，其IC50約為34 μmol·L-1；同時，R7減少LPS及TNFα刺激造成的細胞增殖。50 μmol·L-1 R7可以顯著降低iNOS （P<0001），TNFα （P<0001），IL1β（P<005）以及COX2 （P<0001）的基因表達，不能下調(diào)IL6的基因表達，但可以減少TNFα （P<0001）及IL6 （P<0001）的釋放。進一步的研究表明，不同劑量R7（25，50，100 μmol·L-1）均可顯著抑制NFκB轉錄活性（P<005， P<001及P<0001）。研究表明，R7可以抑制LPS及TNFα聯(lián)合誘導炎癥因子基因表達及分泌，其作用可能與其抑制NFκB轉錄活性相關，提示其在神經(jīng)炎癥相關中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中可能的治療作用。

[關鍵詞]神經(jīng)炎癥；越南人參皂苷R7；脂多糖；炎癥因子；NFκB；星形膠質細胞

[Abstract]To investigate the inhibitory effect and mechanism of vinaginsenoside R7 （R7） on the activation of rat C6 astrocytes cells induced by LPS/TNFα， cells in logarithmic growth phase were cultured in DMEM medium without FBS for 24 h After dissociated using 025% EDTAtrypsin， the cells were seeded into respective plates at the density of 15×106 cells per mL and cultured overnight The cells were divided into the following groups： control group （no treatment）， model group （treated with LPS 1 μg·mL-1 and TNFα 10 μg·L-1 treated for 24 h）， R7 groups （pretreated with 625， 125， 25， 50， and 75 μmol·L-1 R7， 4 μmol·L-1 LNMMA for 2 h and then stimulated with LPS 1 mg·L-1 and TNFα 10 μg·L-1 for 24 h） Cell viability was analyzed by CCK8 kit Secretion of nitric oxide （NO） in the medium was measured by Greiss method Concentrations of interleukin6 （IL6） and tumor necrosis factor （TNFα） were assayed by ELISA kits Gene expressions of inflammatory factors were examined by quantitativePCR analysis Activation of NFκB was detected by dual luciferase reporter gene assay kit The results showed that R7 could significantly inhibit the secretion of NO from C6 cells in a doseeffect manner， with an IC50 of 34 μmol·L-1 And it could reduce cell proliferation induced by LPS/TNFα stimulation Furthermore， R7 at 50 μmol·L-1 significantly downregulated gene expressions of iNOS （P<0001）， TNFα （P<0001）， IL1β（P<005）， and COX2 （P<0001）， but could not change gene expression of IL6 However， R7 reduced the secretion of TNFα （P<0001） and IL6 （P<0001） Further studies disclosed that， different concentrations of R7 （25， 50， 100 μmol·L-1） could significantly inhibit the transcription activity of NFκB（P<005， P<001， and P<0001） In conclusion， R7 could inhibit inflammatory responses in C6 cells induced by LPS/TNFα probably by inhibiting the transcription activity of NFκB， which indicates its possible therapeutic effect in neurological diseases related to neuroinflammation

[Key words]neuroinflammtion；vinaginsenoside R7；LPS； inflammatory factor； NFκB； astrocyte

doi：10.4268/cjcmm20160822

星形膠質細胞（astrocyte）是哺乳動物腦中數(shù)量最多的一類細胞，而膠質酸性纖維蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）為其主要特征成分之一。中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病過程中，常常伴隨著神經(jīng)炎癥，對病程的發(fā)展往往起促進作用。神經(jīng)炎癥的發(fā)生主要由腦內(nèi)膠質細胞，包括星形膠質細胞和小膠質細胞參與。在炎癥條件的刺激下，膠質細胞釋放大量炎癥因子，破壞血腦屏障通透性。而在神經(jīng)炎癥進程中，星形膠質細胞的激活具有2個方面的作用：一方面，通過釋放神經(jīng)促炎因子，趨化因子和補體系統(tǒng)成分調(diào)節(jié)免疫響應；另一方面，產(chǎn)生神經(jīng)保護因子例如神經(jīng)生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子等，對神經(jīng)系統(tǒng)具有修復及保護作用。越南人參皂苷R7（vinaginsenoside R7，R7）為越南人參Panax vietnamensis的主要成分之一[1]，屬達瑪烷型皂苷，在中藥三七P notoginseng （Burk） FHChen中也大量存在，為稀有三七皂苷ST4酶轉化原料[2]。盡管早在1994年已從越南人參中分離得到[1]，目前對R7藥理作用的研究尚屬空白。本實驗使用脂多糖（LPS）及炎癥因子TNFα聯(lián)合誘導大鼠星形膠質C6細胞，建立神經(jīng)炎癥模型，通過檢測NO的釋放，細胞存活率，相關炎癥基因表達，以及炎癥因子的釋放，探討R7對神經(jīng)炎癥的影響。并且，通過檢測NFκB報告基因表達，研究R7對神經(jīng)炎癥的可能的調(diào)控機制。研究結果可能為R7臨床用于神經(jīng)炎癥治療提供理論依據(jù)。

1材料

大鼠星形膠質細胞株C6購于中國科學院細胞庫。

二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，貨號RNBD2520）購自美國Sigma公司；R7購自上海中藥標準化研究中心，用DMSO溶解配制成50 mmol·L-1的貯存母液；DMEM培養(yǎng)基（貨號1661023），胎牛血清（FBS，貨號8172881），025%胰酶（trypsin，貨號25200072），鼠尾膠原（貨號1636475）均購自美國GIBCO公司；細胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿，培養(yǎng)板等購自Eppendorf公司；CoolCell細胞程序降溫盒（Biocision，批號BCS1360）； TNFα ELISA試劑盒（Lot：E094951644）購自eBioscience公司；NFκB質粒由上海中醫(yī)藥大學中藥研究所竇薇副研究員饋贈；APS （Lot：ZQ0922B4013），Tris （Lot：AT08BA0008），Glycine （Lot：A811BA0011），SDS （Lot：ZQ0508B10014J），IL6 ELISA試劑盒（Lot：120401/D），反轉錄cDNA試劑盒（Lot：00155096），Taqman SYBR kit購自Life Technologies公司；β巰基乙醇，甘氨酸，TEMED均購自Geneview公司；BCA蛋白定量試劑盒，PBS粉末，5×SDS 蛋白電泳緩沖液（Lot：3609001100），DNA marker等均購自鼎國生物有限公司；30%丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺 （Lot NO：A01191），4×TrisHClSDS分離膠緩沖液pH 88 （Lot NO：T15356），4×TrisHClSDS濃縮膠緩沖液pH 68 （Lot NO：T16881）均購自翎圣生物；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司。

電子天平購自Sartorius（型號BP211D）；振蕩儀購自Qilinbeier（型號VORTEX5）；臺式高速離心機（型號Centrifuge 5810R），高速離心機（型號5415R）均購自Eppendorf公司；熒光顯微鏡（（型號CKX41）購自Olympus公司；酶標儀（型號Varioskan Flash），CO2培養(yǎng)箱（HERAcell 150i），超凈工作臺（型號1300 SERIES A2）均購自Thermo公司；細胞計數(shù)儀（型號Moxiz）購自Orflo公司；電熱恒溫水浴鍋購自北京市長風儀器儀表公司；GloMax 20/20 Luminometer（貨號E5311）購自Promega公司。

2方法

21C6細胞培養(yǎng)及藥物處理C6細胞于DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，100 U·mL-1青霉素，100 mg·L-1鏈霉素），37 ℃，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并傳代。藥物處理如下：取對數(shù)生長的C6細胞，更換為無血清的DMEM培養(yǎng)基進行饑餓處理，24 h后使用025%胰酶將其消化收集，按15×106個/mL密度接入96孔板饑餓培養(yǎng)過夜。實驗分組如下：對照組（無藥物處理），模型組（LPS 1 mg·L-1，TNFα 10 μg·L-1），給藥組（分別用625，125，50，75 μmol·L-1 R7， 4 μmol·L-1 LNMMA預處理2 h后，再經(jīng)過LPS 1 mg·L-1，TNFα 10 μg·L-1刺激24 h）。

22NO，細胞存活率及毒性檢測NO含量測定采用Griess法，操作如下：收集培養(yǎng)基上清80 μL，與等體積Griess試劑混合，室溫靜置15 min后，酶標

儀于540 nm波長處測定吸光度；以NaNO2作為標準品，同樣方法反應后，繪制標準曲線，進行培養(yǎng)基中NO含量標定。NO的抑制率計算方法如下：抑制率=（[NO2-]LPS/TNFα-[NO2-]LPS/TNFα+樣品）/（[NO2-]LPS/TNFα-[NO2-]對照）×100%[3]。細胞存活率及毒性測定采用CCK8法，步驟如下：96孔板中每孔加入10 μL的CCK8溶液，放入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育15 min，酶標儀于450 nm波長處檢測吸光度，細胞存活率計算方法參照試劑盒說明，存活率=（給藥組吸光度-對照組吸光度）/對照組吸光度×100%。

23炎癥基因表達分析于60 mm2培養(yǎng)皿中接種細胞，按21項下處理方法，進行藥物處理，收取細胞樣品，TRIzol法提取總RNA，去除DNA污染后，使用反轉錄cDNA試劑盒處理，反轉錄為cDNA，按照Taqman SYBR kit試劑盒說明方法進行實時定量PCR。PCR使用引物序列見表1。

24IL6和TNFα檢測于60 mm2培養(yǎng)皿中接種細胞，按21項下方法，對其進行藥物處理后，取100 μL細胞培養(yǎng)基，分別按照ELISA試劑盒使用說明，測定其中IL6及TNFα的含量。

25NFκB轉錄活性檢測采用雙熒光素酶報告基因檢測法，取對數(shù)生長C6細胞，按15×106個/mL濃度接入24孔板過夜培養(yǎng)，至細胞生長90%，吸出24孔板中上清液，使用PBS清洗，每孔加入500 μL OptiMEM；按要求配制混合NFκB質粒（05 μg/孔），每管加75 μL OptiMEM，同時配制lipofectamine 2000，二者混合，靜置5 min后按比例加入板中。實驗分組如下：對照組（未進行藥物處理），模型組（LPS 1 mg·L-1，TNFα 10 μg·L-1），給藥組（分別用25，50，100 μmol·L-1 R7預處理2 h后，再經(jīng)過LPS 1 mg·L-1，TNFα 10 μg·L-1刺激24 h）。按照雙熒光報告基因檢測試劑盒說明，檢測NFκB的激活。

26統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)均采用±s表示，運用PrismDemo 50統(tǒng)計軟件，進行多組間統(tǒng)計分析，經(jīng)OneWay ANOVA Dunnett檢驗，P<005表示有統(tǒng)計學意義。

3結果

31R7對NO釋放影響LPS和TNFα聯(lián)合處理，可以顯著刺激C6星形膠質細胞釋放NO （P<0001）；而R7可以濃度依賴性抑制C6細胞在炎癥因子刺激之下釋放NO，隨著R7濃度的增加，培養(yǎng)基中NO的含量逐漸降低，其半數(shù)抑制率IC50約為34 μmol·L-1，見圖1。

與模型組相比1）P<005， 2） P<001， 3） P<0001（圖2～5同）。

圖1R7對LPS/TNFα誘導的C6細胞NO釋放的作用

Fig1Effect of R7 on LPS/TNFα induced NO release in C6 cells

32R7對細胞活力及毒性的影響因NO的釋放與細胞數(shù)目密切相關，為了考察R7對C6細胞在LPS及TNFα刺激之下NO釋放的抑制是否與其抑制C6細胞活力密切相關，本實驗采用了CCK8法檢測C6細胞的活力，結果見圖2。LPS和TNFα顯著增加細胞的活力（P<0001）；R7對炎癥因子刺激導致細胞活力的上升具有顯著性抑制作用，尤其在R7劑量高于50 μmol·L-1時，作用最為顯著；LPS/TNFα聯(lián)合刺激C6細胞可以使細胞增殖。同時使用CCK8法檢測R7高濃度對細胞的毒性作用；R7高濃度對C6細胞并無毒性作用。結果表明，R7對NO釋放的抑制作用與其抑制LPS/TNFα對細胞的增殖作用有關。

圖2R7對C6細胞存活率及毒性的影響

Fig2Effect of R7 on C6 cell viability and toxicity

33R7對炎癥基因表達的影響基于NO釋放的檢測結果，本實驗進一步考察了R7對C6細胞在受到炎癥因子刺激時，所誘導的炎癥因子的基因表達，結果見圖3。LPS和TNFα聯(lián)合刺激顯著增加細胞中iNOS （P<0001），TNFα（P< 0001），IL6（P<0001），IL1β（P<001）及COX2（P<0001）的基因表達；而R7（50 μmol·L-1）處理，顯著降低C6細胞中iNOS （P<0001），TNFα（P<0001），IL1β（P<005）和COX2 （P<0001）的基因表達，對TLR4有下調(diào)趨勢，但不能抑制IL6基因表達。陽性藥LNMMA可以抑制iNOS（P<005），TNFα（P<0001）及COX2（P<005）基因表達，但不影響IL6，IL1β和TLR4的基因表達。

34R7對炎癥細胞釋放IL6和TNFα的影響為了驗證基因表達檢測的結果，同時確認R7對IL6是否有調(diào)節(jié)作用，本研究采用ELISA法，分別檢測了細胞培養(yǎng)基中的IL6和TNFα的含量，結果見圖4。與對照組相比，模型組的IL6，TNFα釋放量顯著增加（P<0001），而R7（50 μmol·L-1）可以顯著抑制C6細胞中IL6，TNFα的釋放（P<0001）。陽性藥LNMMA僅能顯著抑制TNFα的釋放（P<005），而對IL6的分泌無影響。

35R7對NFκB轉錄活性的影響LPS和TNFα聯(lián)合刺激，顯著增強細胞中NFκB蛋白的轉錄活性（P<0001）；而不同劑量的R7處理，均可以顯著抑制其轉錄活性，當其濃度達到100 μmol·L-1時抑制效果最為顯著（P<0001），見圖5。

4討論

R7盡管發(fā)現(xiàn)于20多年以前，但本實驗首次發(fā)現(xiàn)其具有抑制星形膠質細胞激活的作用，它可以顯著抑制LPS及TNFα刺激下的星形膠質細胞C6的激活，減少細胞中NO釋放，IL6及TNFα的分泌，調(diào)控炎癥基因iNOS，TNFα及COX2的表達，而其作用可能是通過降低NFκB轉錄因子的激活實現(xiàn)。

星形膠質細胞作為神經(jīng)系統(tǒng)主要的神經(jīng)細胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中負責提供營養(yǎng)，維持神經(jīng)遞質傳遞，同時具有廣泛維持腦內(nèi)環(huán)境平衡的功能。神經(jīng)炎癥是由膠質細胞激活參與的病理反應[4]。過去認為在神經(jīng)系統(tǒng)中，小膠質細胞為神經(jīng)炎癥主要的參與對象[5]。后來的研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖及炎癥因子等外來刺激、損傷或疾病時，星形膠質細胞也進入激活狀態(tài)，表現(xiàn)為GFAP顯著升高，釋放NO，IL6，TNFα[6]等致炎因子，并向小膠質細胞傳遞炎癥信號，促進小膠質細胞激活，進一步擴大炎癥反應[78]。本實驗中R7對于下游NO釋放的顯著抑制作用，并減少IL6和TNFα等致炎因子的分泌，表明其可有效減輕星形膠質細胞激活導致的炎癥進程。

脂多糖為革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，常用于誘導炎癥模型的發(fā)生。LBP和CD14幫助TLR4受體識別LPS，形成TLR4/MD2受體復合物，通過MyD88依賴性通路及TRIF通路，分別釋放促炎因子和Ι型干擾素基因[9]。炎癥因子TNFα全名腫瘤壞死因子α，為一種系統(tǒng)性炎癥的細胞因子，可引起急性炎癥反應。當其結合TNFR1或TNFR2受體時形成三聚體，發(fā)生構象改變使抑制蛋白SODD從細胞內(nèi)致死區(qū)域分離，從而使接頭蛋白TRADD連接至細胞致死區(qū)域，激活下方3種通路途徑[1011]。無論由脂多糖結合TLR4受體，還是由炎癥因子TNFα誘導的TNFα信號通路，最終都引起NFκB轉位入核，結合靶基因啟動位點后誘導不同致炎因子的表達[12]。NFκB入核后激活細胞核內(nèi)相關炎癥基因，上調(diào)IL1β，IL6基因的表達，刺激細胞分泌IL1β，IL6等下游產(chǎn)物。本實驗中，R7顯著性抑制NFκB啟動入核結合的表達，IL1β，IL6基因表達，減少細胞分泌IL1β，IL6，表明R7確實具有抑制炎癥作用。

本實驗CCK細胞活力檢測結果顯示R7可以通過抑制由LPS/TNFα聯(lián)合刺激C6細胞引起的活力的增加，提示其可能抑制星形細胞的增殖，與此同時R7并未下調(diào)細胞中IL6基因的表達，但減少了IL6的分泌，表明R7可能通過影響細胞數(shù)量降低IL6蛋白的分泌。

本實驗采用LNMMA作為陽性對照藥物，研究表明，該化合物主要為總NOS抑制劑，可以有效降低NO的生成。在本實驗中，LNMMA的確如文獻報道[13]所述，可以有效抑制C6細胞NO的產(chǎn)生，與此同時，它也可以有效抑制iNOS，TNFα及COX2（P<005）的基因表達；NFκB轉錄活性測定亦表明它可以有效抑制NFκB。這些結果提示，LNMMA的作用靶點可能并不唯一。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)R7不僅可以抑制神經(jīng)炎癥中下游代謝產(chǎn)物的生成，還影響多種炎癥基因的表達，降低炎癥過程中炎癥因子的分泌，其機制與抑制NFκB轉錄因子的轉錄活性相關，提示其在神經(jīng)炎癥相關中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中的作用。

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[責任編輯馬超一]