張文秀 楊彪 胡玉梅 孟兆青 黃文哲 王振中 蕭偉

[摘要]在離體培養(yǎng)的大鼠腸道菌群中加入類葉升麻苷進(jìn)行厭氧孵育。采用HPLC監(jiān)測類葉升麻苷在不同孵育時(shí)間點(diǎn)的變化，同時(shí)運(yùn)用HPLCQTOFMS鑒定類葉升麻苷的代謝產(chǎn)物。結(jié)果表明離體的大鼠腸道菌群可以對類葉升麻苷進(jìn)行代謝，代謝產(chǎn)物分別是3，4二羥基苯乙醇、咖啡酸和3（3′羥苯基）丙酸。

[關(guān)鍵詞]類葉升麻苷；腸道菌群；代謝產(chǎn)物；液質(zhì)聯(lián)用

[Abstract]Acteoside was used for anaerobic incubation with rat intestinal flora in vitro. HPLC was used to detect the changes of acteoside at different incubation time points and HPLCQTOFMS was used to identify the metabolites of acteoside. The results showed that acteoside could be metabolized by rat intestinal flora in vitro and the metabolites were 3，4dihydroxyphenyl acid， caffeic acid and 3（3′hydroxyphenyl） propionic acid.

[Key words]acteoside； intestinal flora； metabolites； LCMS

doi：10.4268/cjcmm20160829

類葉升麻苷（acteoside），又名毛蕊花糖苷和洋丁香酚苷[1]，屬于苯乙醇苷類化合物（圖1）。地黃[2]、肉蓯蓉[3]、枇杷葉紫珠[4]和益母草[5]等藥材中均含有類葉升麻苷?，F(xiàn)代藥理研究表明，類葉升麻苷具有改善腦損傷[6]、改善急性肺損傷[7]、抗炎[89]、抗氧化[1011]和抗癌[1214]的作用。此外還具有抑制脂肪吸收，治療肥胖[15]的功效，可見其在生物體內(nèi)具有顯著活性。但文獻(xiàn)報(bào)道類葉升麻苷生物利用度僅為012%，為吸收不良藥物[16]。腸道菌群在糖苷類化合物的代謝過程中起著重要作用，大多數(shù)糖苷類化合物可經(jīng)腸道菌群酶解為苷元等代謝產(chǎn)物而發(fā)揮藥效[1718]。

本文建立了用于代謝物分離及定性的液質(zhì)聯(lián)用法（HPLCQTOFMS），能夠提供色譜峰、相對分子質(zhì)量、子離子碎片質(zhì)荷比，這為代謝產(chǎn)物的鑒定提供了豐富的信息。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究類葉升麻苷在體內(nèi)的代謝奠定基礎(chǔ)。

1材料

YQXⅡ厭氧培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；METTLER XS205微量分析天平（南京皓?？茖W(xué)儀器儀表有限公司）；Eppendorf5424小型高速離心機(jī)（北京東南儀誠實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司）；XW80A微型漩渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；MLS3751L高壓蒸氣滅菌鍋（松下健康醫(yī)療器械株式會社）；氮吹儀（美國 Organomation Associates公司）；ZK82B電熱真空干燥箱（上海儀器廠有限公司）；Agilent 1100 HPLC（美國安捷倫公司），包括在線脫氣機(jī)，四元泵，高性能自動進(jìn)樣器，柱溫箱，二極管陣列檢測器；安捷倫6210高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，配有標(biāo)準(zhǔn)電噴霧離子源（ESI）及MassHunter Acquisition和MassHunter Qualitative工作站；MilliQ超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

類葉升麻苷對照品（批號131014，成都普菲德生物技術(shù)有限公司）；磷酸氫二鉀、硫酸銨、硫酸鎂、L半胱氨酸、L抗壞血酸、牛肉膏、胰蛋白胨（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸二氫鉀、氯化鈉、無水氯化鈣、無水碳酸鈉、濃鹽酸、甲醇、乙酸乙酯（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司）；乙腈、甲酸（色譜純，美國天地公司）；蒸餾水由MilliQ超純水系統(tǒng)制得。

SD大鼠6只，體重（250±10） g，由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供，合格證號SCXK （蘇） 20150002。

2方法與結(jié)果

21厭氧培養(yǎng)基的制備[19]

375 mL溶液A（078% K2HPO4），375 mL溶液B[含047%KH2PO4，118%的NaCl，12% （NH4）2SO4，012% CaCl2，025% MgSO4·H2O]，05 g L半胱氨酸，20 mL 25%的L抗壞血酸，50 mL 8%的Na2CO3，將10 g牛肉提取物和10 g胰蛋白胨溶于蒸餾水中，然后用1 mol·L-1鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至75～77，定容至1 L。所獲得的厭氧培養(yǎng)液分裝于EP管中，在115 ℃以007 MPa高壓滅菌，備用。

22糞便的獲取與處理及腸菌培養(yǎng)液的制備

取一干凈塑料袋，充滿氮?dú)?，裝入大鼠新鮮糞便，用手?jǐn)D壓使之勻質(zhì)化。按1∶4加入生理鹽水混合制成懸濁液，用雙層紗布過濾，過濾液即為腸菌液，2 000 r·min-1離心10 min得上清液，即為腸菌液。取腸道菌液10 mL于培養(yǎng)瓶中，再加入15 mL厭氧培養(yǎng)液，混勻，即得腸菌培養(yǎng)液。整個(gè)過程于氮?dú)饬飨虏僮鳌?/p>

23類葉升麻苷溶液的配制

精密稱取類葉升麻苷對照品252 mg，溶于25 mL蒸餾水中，即配制成質(zhì)量濃度為1 g·L-1的類葉升麻苷溶液，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

24藥液在腸道菌群中的孵育

取上述大鼠腸菌培養(yǎng)液18 mL，加入12 mL質(zhì)量濃度為1 g·L-1的類葉升麻苷溶液，混勻，然后將溶液分裝（05 mL/管）。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。將實(shí)驗(yàn)組、空白組分別于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育，在05，2，4，8，24，48 h后分別取樣，加05 mL甲醇終止反應(yīng)，漩渦振蕩2 min。以1萬 r· min-1離心10 min，取上清液07 mL置EP管中，氮?dú)饬鞔蹈?。殘?jiān)謩e加50%甲醇100 μL溶解，用乙酸乙酯萃取3次，每次400 μL，合并萃取液，減壓蒸干。殘?jiān)?00 μL的50%甲醇進(jìn)行復(fù)溶，12 000 r·min-1離心10 min，移取上清液，以備進(jìn)樣分析。

25HPLC分析類葉升麻苷在離體大鼠腸道菌群孵育液中的變化

251色譜條件Zorbax Eclipse plus C18 色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm）；流動相A為01%甲酸水，B為乙腈，梯度洗脫，0～10 min，10%～20%B，10～20 min，20%～40%B，20～25 min，40%～50%B，25～30 min，50%～70%B，30～40 min，70%～100%B，流速10 mL·min-1；檢測波長276 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

252類葉升麻苷孵育液的HPLC分析根據(jù)已建立的HPLC方法，對實(shí)驗(yàn)組和空白組進(jìn)行分析，在實(shí)驗(yàn)組孵育液中檢測到類葉升麻苷的原型（M0）及3個(gè)代謝產(chǎn)物M1，M2，M3，并且觀察到24 h以前的代謝產(chǎn)物主要是M1，M2，48 h后出現(xiàn)的代謝產(chǎn)物主要是M3（圖2）。

26HPLCQTOFMS分析類葉升麻苷在離體大鼠腸道菌群孵育液中的代謝產(chǎn)物

261色譜條件以25項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行。

262質(zhì)譜條件離子源為電噴霧離子源（ESI）；正負(fù)離子檢測模式，掃描范圍m/z 100～3 000；干燥

氣流量8 L·min-1；霧化器壓力35 Pa；干燥氣溫度350 ℃；毛細(xì)管電壓（+）40 kV，毛細(xì)管電壓（-）35 kV；干燥器溫度325 ℃；毛細(xì)管出口電壓135 V；錐孔電壓65 V；八級桿電壓750 V。

263類葉升麻苷及其代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜解析M0的正離子一級質(zhì)譜中顯示了m/z 1 271[2M+Na]+，647[M+Na]+的準(zhǔn)分子離子峰，m/z 471[M+H-C8H10O3]+，325[M+H-C8H10O3-C6H10O4]+，163[M+H-C8H10O3-C6H10O4C9H6O3]+的碎片離子峰，這與負(fù)離子一級質(zhì)譜圖中m/z 623[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰相互驗(yàn)證了該化合物的相對分子質(zhì)量為624，即類葉升麻苷（圖3）。

經(jīng)分析，實(shí)驗(yàn)組48 h孵育液質(zhì)譜圖中代謝產(chǎn)物M2正離子響應(yīng)較差，負(fù)離子響應(yīng)雖好但不足以確證該化合物結(jié)構(gòu)，因此選擇實(shí)驗(yàn)組8 h孵育液質(zhì)譜圖分析該代謝產(chǎn)物。M2的正離子一級質(zhì)譜中顯示了m/z 181[M+H]+的準(zhǔn)分子離子峰和m/z 163[M+H-H2O]+，118[M2+H-H2O-COOH]+的碎片離子峰；負(fù)離子一級質(zhì)譜圖中顯示了m/z 179[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰和m/z 135[M-H-COOH]-的碎片離子峰。其質(zhì)譜行為與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)相一致[21]，所以確定其相對分子質(zhì)量180的代謝產(chǎn)物M2是咖啡酸（圖5）。

M3的正離子一級質(zhì)譜中顯示了m/z 189[M+Na]+的準(zhǔn)分子離子峰和m/z 149[M+H-H2O]+的碎片離子峰；負(fù)離子一級質(zhì)譜圖中顯示了m/z 165[M-H]-相互驗(yàn)證的準(zhǔn)分子離子峰。推測此相對分子質(zhì)量166的代謝產(chǎn)物M3是3（3′羥苯基）丙酸（圖6）。

根據(jù)上述分析結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)[2223]，推測離體培養(yǎng)的大鼠腸道菌群對類葉升麻苷可能的代謝轉(zhuǎn)化途徑（圖7）。

3討論

近年來，中藥糖苷類化合物因其顯著的藥效活性受到研究者的廣泛關(guān)注。研究表明糖苷類化合物在腸道菌的作用下極易發(fā)生苷鍵的水解反應(yīng)，這可能與腸道廣泛存在的糖苷鍵水解酶有關(guān)[24]。但本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)苷元N，而是發(fā)現(xiàn)了在其基礎(chǔ)上進(jìn)一步脫失的基團(tuán)。故推測苷元N不穩(wěn)定，極易被腸道內(nèi)菌群代謝為3，4二羥基苯乙醇（M1）和咖啡酸（M2）。文獻(xiàn)報(bào)道咖啡酸（M2）可經(jīng)還原酶（RA）發(fā)生氫化作用生成二氫咖啡酸，二氫咖啡酸會發(fā)生C4位脫羥基作用生成 3（3′羥苯基）丙酸（M3） [25]。

本實(shí)驗(yàn)只考察了體外腸道菌群對類葉升麻苷的代謝轉(zhuǎn)化，尚未進(jìn)行其在體內(nèi)的代謝研究，可在后續(xù)研究中深入考察類葉升麻苷在生物體內(nèi)代謝的情況，為闡明類葉升麻苷體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

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[責(zé)任編輯曹陽陽]