許正新, 鄭　雪, 朱　磊

(揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225001)

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蛇床子素對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞鈉通道的影響

許正新, 鄭雪, 朱磊

(揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225001)

摘要:目的探討蛇床子素對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞鈉離子通道電流(I(Na))的影響。方法采用Langendorff 裝置，恒壓恒溫灌流及酶解消化等方法對(duì)大鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行分離和處理。應(yīng)用膜片鉗技術(shù)，觀察給予不同濃度蛇床子素(Ost)后鈉離子通道電流特征的變化。結(jié)果Ost(>100 μmol/L)能明顯抑制鈉電流，其作用呈濃度依賴性(500 μmol/L幾乎完全阻斷)和時(shí)間依賴性(10 min左右抑制力達(dá)到最強(qiáng))。100 μmol/L和300 μmol/L Ost使鈉電流I-V曲線明顯上移，峰值鈉電流(-29.8±4.21) pA/pF分別降為(-20.1±3.7) pA/pF和 (-17.7±5.7 ) pA/pF (P<0.05)，但激活電位和峰電位沒有改變。對(duì)于鈉通道失活曲線，不同濃度的Ost能使其向超級(jí)化方向移動(dòng)，V(1/2)(空白，100 μmol/L，300 μmol/L)分別為(-81.10±0.35)、(-91.62±1.06)、(-100.60±0.21) mV (P<0.01)。Ost還能顯著延長(zhǎng)鈉通道失活后恢復(fù)時(shí)間，τ(空白，100 μmol/L，300 μmol/L)分別為(15.09±0.78)、(23.41±1.23)、(31.62±0.97) ms (P<0.01)。結(jié)論Ost對(duì)大鼠心室肌鈉通道電流有明顯的抑制作用。

關(guān)鍵詞:蛇床子素; 鈉通道; 心室肌; 大鼠; 膜片鉗

蛇床子素，又名甲氧基歐芹酚 (Ost)，是從傘形科蛇床子屬植物蛇床的果實(shí)中提取的一種香豆素類化合物，化學(xué)名稱為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素，是蛇床子中含量最高(約1%)的一種烴基香豆素類有效化學(xué)成分[1]。研究[2-4]報(bào)道, Ost具有降低血壓、抗心律失常、抑制心臟、擴(kuò)張血管等一系列心血管藥理作用。此外，該藥對(duì)免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)也能產(chǎn)生一定影響[5-6]，同時(shí)具有抗菌[7-8]、止癢[9-12]等效應(yīng)。本研究探討蛇床子素對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞鈉離子通道電流(INa)的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1動(dòng)物

SD大鼠(200～300 g)，揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，雌雄不拘。

1.2藥品與試劑

蛇床子素購(gòu)自成都普思生物科技有限公司，HEPES、牛磺酸、葡萄糖購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，膠原酶Ⅱ購(gòu)自Worthington公司，其余均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3溶液配制

臺(tái)氏液(mM): NaCl 135; KCl 5.4; MgCl21; CaCl21.8; HEPES 5; NaH2PO40.33; glucose 10; pH值用 NaOH調(diào)至7.30～7.40。無鈣臺(tái)氏液：臺(tái)氏液中去除CaCl2即可。酶液: 無鈣臺(tái)氏液中加入0.4 g/L膠原酶Ⅱ, 1g/L的BSA和30 μmol/L的CaCl2。

KB液(mM): L-glutamic acid 70; KCl 25；taurine 10; NaH2PO410;

HEPES 5; glucose 11; EGTA 0.5(用KOH 調(diào)pH至7.30～7.40)。

細(xì)胞外液(mM): NaCl 5; CsCl 140; MgCl21; CaCl21; CoCl21; glucose 10; HEPES 10 (用CsOH調(diào)pH至7.30)。電極內(nèi)液(mM): CsCl 133; NaCl 5; TEACl 20; EGTA 10; HEPES 10; MgATP 5 (用CsOH調(diào)pH至7.2)。

1.4大鼠心室肌細(xì)胞分離

整個(gè)大鼠心室肌細(xì)胞分離過程參照文獻(xiàn)[13]并略作改進(jìn)。大鼠腹腔注射肝素2 000 IU/kg, 約15 min后繼續(xù)腹腔注射2%戊巴比妥鈉(8 mL/kg)。麻醉成功后開胸迅速取下心臟置于預(yù)先以100% O2飽和的4℃臺(tái)式液中，常規(guī)整理、清洗、固定，經(jīng)主動(dòng)脈行Langendorff 灌流。其程序?yàn)椋合扔门_(tái)式液經(jīng)主動(dòng)脈逆行灌流約1 min，使心臟復(fù)跳排出心腔殘留血液，繼之以無鈣臺(tái)氏液灌流心臟約8 min，直至心臟停跳為止。最后用預(yù)先以純氧飽和的酶溶液50 mL循環(huán)灌流20～30 min，直至心臟變得柔軟、松弛，流出液渾濁并呈拉絲狀。整個(gè)灌流過程在37℃恒溫、灌流液中持續(xù)通純氧的條件下進(jìn)行。酶解消化結(jié)束后分離并剪碎心室組織，在KB液中輕輕吹打以游離出單個(gè)心室肌細(xì)胞，過濾得到細(xì)胞混懸液，貯存于KB液中，靜置2 h后待用。期間重復(fù)換液3次。

1.5全細(xì)胞膜片鉗記錄

將細(xì)胞置于培養(yǎng)皿中靜置10～20 min，待其貼壁后換用細(xì)胞外液進(jìn)行灌流以除去殘存的KB液。使用P-97水平拉制儀拉制玻璃微電極，電極入液電阻保持在2～3 MΩ，選用邊緣完整、橫紋清晰、表面光滑無顆粒感的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。串聯(lián)電阻補(bǔ)償60%。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用PatchMaster軟件采集所記錄電流，結(jié)合使用Origin70和graphpadprism5.1對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換分析以及擬合。以SPSS 16.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。顯著性檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

2結(jié)果

2.1Ost對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞INa影響的時(shí)間依賴性

保持電位-80 mV，給予指令電壓為-30 mV，脈寬50 ms，頻率0.5 Hz的方波單刺激，記錄鈉電流。由于電流記錄之初(0～5 min)，電流大小不穩(wěn)定，所以不采集此段的數(shù)據(jù)。5～10 min后電流趨于穩(wěn)定后觀察給藥前后INa峰值的大小。當(dāng)100 μmol/L蛇床子素作用10 min之后，INa即明顯減弱(降低31.6%)(圖1A)；隨著藥物劑量的增加，當(dāng)300 μmol/L蛇床子素作用10 min之后，INa減弱更加明顯(降低58.2%)(圖1B)。使用正常的細(xì)胞外液灌流5 min，INa可部分恢復(fù)。由此證明，INa的減小是Ost對(duì)電流的抑制作用。

2.2Ost對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞INaI-V曲線的影響

在電壓鉗模式下，保持電位-80 mV，給予-70～+40 mV、階躍5 mV、持續(xù)時(shí)間30 ms的方波串刺激，刺激頻率0.5 Hz，記錄給藥前后的INa(圖2A)，以電流密度對(duì)相應(yīng)的電壓作圖，繪制出INa的I-V曲線(圖2B)。Ost 可使INa的 I-V曲線顯著上移，100 μmol/L和300 μmol/L蛇床子素使峰值鈉電流(-29.8±4.21) pA/pF分別降為(-20.1±3.7) pA/pF and (-17.7±5.7 ) pA/pF (P<0.01), 但I(xiàn)-V曲線的形狀、激活電位、峰電位和反轉(zhuǎn)電位不改變。

圖1　100 μmol/L 和300μmol/L蛇床子素對(duì)INa抑制作用的時(shí)間依賴性

與對(duì)照組加藥前比較, **P<0.01。

圖2100μmol/L 和300μmol/L蛇床子素對(duì)INa影響的原始曲線及I-V曲線

2.3Ost對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞INa影響的濃度

依賴性

刺激方案同2.1。采用累積加藥法，分別觀察 10、50、100、200、300、400、500 μmol/L Ost對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞INa的影響(圖3)。當(dāng)Ost濃度為10 μmol/L和50 μmol/L時(shí)，其對(duì)INa無明顯作用，但當(dāng)濃度大于此值時(shí)，隨著藥物濃度的增加，對(duì)電流的抑制作用也隨之增強(qiáng)，表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性抑制現(xiàn)象。

與對(duì)照組加藥前比較,**P<0.01。圖3 不同濃度蛇床子素對(duì)INa的影響

2.4蛇床子素對(duì)INa失活動(dòng)力學(xué)的影響

在電壓鉗模式下，采用雙脈沖刺激法。保持電位-80 mV, 條件脈沖從-140 mV開始逐步去極化至+30 mV，階躍10 mV，持續(xù)時(shí)間50 ms, 然后再給予去極化至-30 mV, 持續(xù)時(shí)間25 ms的測(cè)試脈沖，分別引導(dǎo)出給藥前后INa的失活電流，以相對(duì)電流I/Imax對(duì)各膜電位作圖，采用Boltzmann方程I/Imax =1/{ 1 + exp [ (V-V1/2)/k ] }進(jìn)行擬合，得到穩(wěn)態(tài)失活曲線，其中V1/2代表50 %通道失活時(shí)的條件脈沖電壓, k為斜率因子。Ost能使INa的失活曲線顯著左移，即向超極化方向移動(dòng)，100 μmol/L 和300 μmol/L蛇床子素使V1/2由用藥前的(-81.10±0.35) mV分別變?yōu)?-91.62±1.06) mV和 (-100.60±0.21) mV (n=10,P<0.01)，k從(9.95±0.31) mV變?yōu)?9.93±0.18) mV(n=10,P>0.05)和(12.70±0.94 ) mV (P<0.01)。所以，Ost可明顯改變INa的失活動(dòng)力學(xué)特征，加快INa的失活。見圖4和表1。

2.5蛇床子素對(duì)INa失活后恢復(fù)動(dòng)力學(xué)的影響

在電壓鉗模式下，采用雙脈沖刺激法，保持電位為-80 mV, 給予去極化至-30 mV的刺激，持續(xù)30、5 ms后，再給予去極化至-30 mV、30 ms的刺激，前后2個(gè)脈沖的間隔時(shí)間以5 ms的幅度逐漸增加，共20個(gè)脈沖。分別引出用藥前后INa的復(fù)活電流，以相對(duì)電流I/Imax對(duì)時(shí)間間隔作圖，用指數(shù)方程I/Imax=1-exp(-t/)擬合。t為兩脈沖之間的時(shí)間間隔，為滅活后再激活(61.8%)的時(shí)間常數(shù)。Ost能使INa的失活后恢復(fù)曲線顯著右移，由給藥前的(15.09±0.78) ms變?yōu)?23.41±1.23) ms和(31.62±0.97) ms(P<0.01)。Ost可明顯改變INa的失活后恢復(fù)動(dòng)力學(xué)特征，使INa從失活態(tài)向激活態(tài)轉(zhuǎn)變的時(shí)間延長(zhǎng)。見圖5和表1

圖4　蛇床子素對(duì)INa失活曲線的影響

與空白相比, *P<0.05, **P<0.01。

與對(duì)照組加藥前比較, **P<0.01。

圖5蛇床子素對(duì)INa失活后恢復(fù)曲線的影響

3討論

目前有關(guān)Ost對(duì)離子通道影響的報(bào)道還較少，袁春華等[10]證實(shí)了Ost能抑制多種鈣通道亞型并表現(xiàn)出不同的親和力。近年來，隨著電生理技術(shù)的發(fā)展，尤其是膜片鉗技術(shù)的應(yīng)用，使人類有能力從分子水平來探討離子通道的結(jié)構(gòu)和功能，以及其與疾病的關(guān)系。研究表明，心肌細(xì)胞上離子通道與很多心血管系統(tǒng)疾病有相關(guān)性。

鈉通道是選擇性允許Na+跨膜通過的離子通道，主要是電壓門控離子通道，其功能是維持細(xì)胞興奮性及其傳導(dǎo)。在心臟、神經(jīng)和肌肉細(xì)胞，動(dòng)作電位始于快鈉通道的激活，鈉離子內(nèi)流引起動(dòng)作電位的0期去極化。INa異常會(huì)導(dǎo)致一系列的心律失常。本實(shí)驗(yàn)采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察了蛇床子素(Ost)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞INa幅值、I-V曲線及其失活和恢復(fù)動(dòng)力學(xué)的影響。結(jié)果表明，Ost可以濃度依賴性地抑制鈉電流。其中，100 M Ost可使INaI-V曲線明顯上移，但并不改變I-V曲線的激活電位、峰電位和反轉(zhuǎn)電位，提示Ost在不同膜電位水平對(duì)INa具有均勻一致的抑制作用。Ost使INa的失活曲線顯著左移，即向超極化方向移動(dòng)，加快鈉通道的失活。而對(duì)失活后恢復(fù)曲線則使其顯著右移，使INa從失活態(tài)恢復(fù)的時(shí)間延長(zhǎng)。此外，Ost對(duì)鈉電流的抑制作用還具有濃度依賴性，在100～500 μmol/L范圍內(nèi)，隨著藥物濃度的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)。此分子水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與整體實(shí)驗(yàn)[3，14]中Ost的作用相一致，可以部分解釋其抗心律失常效應(yīng)的作用基礎(chǔ)，從而為該藥及其同類藥物的進(jìn)一步開發(fā)、應(yīng)用及指導(dǎo)臨床合理用藥提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

關(guān)于受Ost影響的鈉通道的狀態(tài)，綜合整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作者發(fā)現(xiàn)Ost對(duì)激活、失活、失活后恢復(fù)等過程均有影響。說明該藥不僅作用于鈉通道的靜息狀態(tài)或激活狀態(tài)，對(duì)通道的失活也有抑制作用，故Ost對(duì)鈉通道的不同狀態(tài)都是存在一定的抑制作用，只是親和力不同或者結(jié)合與解離的速度不同[15]。作者通過直接在細(xì)胞外液中加入藥物來觀察Ost對(duì)鈉通道的影響，還可以考慮通過在電極內(nèi)液中加入同樣濃度的Ost來比較內(nèi)、外部給藥作用的差別，以此來判斷藥物與通道的結(jié)合位點(diǎn)是更靠近膜內(nèi)側(cè)還是外側(cè)。

Ost為中國(guó)傳統(tǒng)中藥蛇床子中的提取物，研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)心血管系統(tǒng)的影響，包括其抗心律失常作用。Ost對(duì)氯仿誘發(fā)的小鼠室顫、CaCl2誘發(fā)的大鼠室顫均有明顯的預(yù)防作用，對(duì)烏頭堿誘發(fā)的大鼠心律失常也有療效。Fabio F等[16]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ost對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的Ca2+通道具有抑制作用。關(guān)于Ost的確切作用機(jī)制或其對(duì)離子通道的直接影響尚不清楚。由于心律失常發(fā)生的機(jī)制非常復(fù)雜，有眾多的離子通道參與，臨床上的一系列抗心律失常藥物可分別從鈉通道、鉀通道和鈣通道等途徑發(fā)揮相關(guān)的作用。因此，本研究從心肌鈉離子通道方面探討Ost對(duì)該通道的影響具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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Effect of osthole on sodium channels of ventricular myocytes in rat

XU Zhengxin, ZHENG Xue, ZHU Lei

(MedicalCollegeofYangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu, 225001)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the effect of osthole on sodium channel current of ventricular myocytes in rats. MethodsCardiomyocytes were enzymatically dissociated from SD rats by Langendorrf with constant pressure and temperature. Whole-cell patch clamp techniques were used to evaluate the changes of sodium channel current characteristics at different concentrations of osthole. ResultsOsthole (>100 μmol/L) inhibited sodium current in a concentration-dependent (500 μmol/L almost blocked completely) and time-dependent manner (it blocked sodium current quickly and the strongest inhibition appeared 10 minutes later). The I-V curves of the sodium current raised obviously with the peak current density from (-29.8±4.21) pA/pF to (-20.1±3.7) pA/pF and (-17.7±5.7 ) pA/pF (P<0.01) at concentration of 100 μmol/L and 300 μmol/L, but the activation potential and peak potential did not change. In addition, osthole at different concentration caused significant hyperpolarizing shifts in voltage-dependent channel inactivation of I(Na). 100 μmol/L and 300 μmol/L Ost shifted the V(1/2) of I(Na) from (-81.10±0.35) mV in control to (-91.62 ±1.06) mV and (-100.60±0.21) mV. Ost could significantly prolong the sodium channel recovery time from inactivation with τ increasing from (15.09±0.78) ms in control to (23.41±1.23) ms and (31.62±0.97) ms (n=10, P<0.01). ConclusionOsthole can significantly inhibit sodium current of ventricular myocytes in rat.

KEYWORDS:osthole; sodium channel; ventricular myocytes; rats; patch clamp

中圖分類號(hào):R 542.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2016)07-001-05

DOI:10.7619/jcmp.201607001

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO. 31071171)

收稿日期:2015-11-20