欒海蓉,孫　健,王得利,李　麗,吳　紅

(牡丹江醫(yī)學(xué)院機能學(xué)教研室/黑龍江省高校腫瘤疾病防治重點實驗室，黑龍江牡丹江 157011)

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M3受體激動劑對急性缺血性心肌的保護(hù)作用*

欒海蓉,孫健,王得利,李麗,吳紅△

(牡丹江醫(yī)學(xué)院機能學(xué)教研室/黑龍江省高校腫瘤疾病防治重點實驗室，黑龍江牡丹江 157011)

[摘要]目的研究M3受體激動劑膽堿對大鼠急性缺血性心肌的保護(hù)作用其可能的機制。方法用低pH值(pH 6.8)乏氧液來模擬缺血環(huán)境，全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄L-型鈣電流(ICa-L)變化；激光掃描共聚焦技術(shù)觀測細(xì)胞內(nèi)鈣變化，探討膽堿對細(xì)胞內(nèi)鈣及鈣庫的影響。結(jié)果在膜片鉗實驗結(jié)果顯示，與正常組比較， 缺血組ICa-L電流密度明顯增高，應(yīng)用膽堿后ICa-L下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；共聚焦實驗結(jié)果顯示，與正常組比較，缺血組細(xì)胞內(nèi)鈣升高明顯(P<0.01)，膽堿組細(xì)胞內(nèi)鈣升高幅度不明顯；預(yù)先給予4-DAMP可部分逆轉(zhuǎn)膽堿抑制細(xì)胞ICa-L及細(xì)胞內(nèi)鈣升高的作用。結(jié)論M3受體參與保護(hù)缺血心肌的可能機制為通過抑制缺血心肌細(xì)胞ICa-L，從而抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載。

[關(guān)鍵詞]心肌缺血；膽堿；L-型鈣電流；膜片鉗；激光掃描共聚焦

心臟是人體的重要器官，維持全身血液的供應(yīng)，心肌缺血及梗死都存在局部供血和代謝障礙，缺血時的細(xì)胞外體內(nèi)微環(huán)境改變主要是酸性代謝產(chǎn)物排出困難，從而造成堆積，形成酸中毒，進(jìn)而導(dǎo)致心律失常發(fā)生[1-2]。心律失常尤其是缺血梗死后心律失常，其病理過程中細(xì)胞內(nèi)鈣超載是心肌損傷的主要分子基礎(chǔ)。

研究發(fā)現(xiàn)，心肌M3受體在病理狀態(tài)下，功能性表達(dá)明顯增加[3-5]。這提示，心肌M3受體可能在疾病狀態(tài)下發(fā)揮更重要的作用。本研究探討M3受體激動劑膽堿對缺血性心肌保護(hù)的可能機制，對心臟M3受體做進(jìn)一步的研究與探討，以利于尋求合理的治療策略和開發(fā)更安全有效的心肌保護(hù)藥物。

1材料與方法

1.1材料健康清潔級Wistar大鼠，成年雄性，體質(zhì)量250～300 g，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，動物生產(chǎn)許可號：SCXK(黑)2011006，動物使用許可證號：SYXK(黑)2011007。

1.2儀器和試劑HEPES(N-2-hydroxyethylpiperazine-N′-2-ethanesulfonic acid)、乙二醇四乙酸酯(EGTA)、膠原酶Ⅱ(typeⅡ)、牛血清清蛋白(BSA)、咖啡因(Caffeine)均購自于Sigma公司；Fluo-3/AM，F(xiàn)-127購自美國Invitrogen公司，用二甲基亞砜(DMSO)配制成888 μmol/L原液，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩MSO、戊巴比妥鈉(sodium pentobarbital)、肝素(heparin)等均為國產(chǎn)分析純。采用BL-420E生物功能實驗系統(tǒng)，成都泰盟科技公司；pH計(P-240型)，Corning公司，德國；膜片鉗放大器，Axopatch 200B，Axon公司，美國；膜片鉗數(shù)模轉(zhuǎn)換器，Digidata 1322，Axon公司，美國；倒置顯微鏡，TE 2000-U，Nikon，日本；三維液壓推進(jìn)器，MHW-3，Narishige公司，日本；氣壓減震臺，TMC，美國；溫度控制儀，NBD TC2bip，Cell Micro Controls，美國；微電極電極拉制儀，PP-830，Narishige，日本；FV-300激光掃描共聚焦顯微鏡，Olympus公司，日本。溶液：細(xì)胞保存液(KB液)谷氨酸 70 mmol/L、氨基乙磺酸15 mmol/L、KCl 30 mmol/L、KH2PO410 mmol/L、MgCl20.5 mmol/L、EGTA 0.5 mmol/L、羥乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)10 mmol/L、葡萄糖10 mmol/L，用KOH調(diào)pH至7.3～7.4 mmol/L。臺氏液NaCl 126 mmol/L、KCl 5.4 mmol/L、MgCl21 mmol/L、CaCl21.8 mmol/L、NaH2PO40.33 mmol/L、葡萄糖10 mmol/L、Hepes 10 mmol/L，用NaOH調(diào)pH至7.4 mmol/L。無鈣臺氏液除沒有CaCl2之外，其余成分與臺氏液相同。缺血臺氏液NaCl 126 mmol/L、KCl 5.4 mmol/L、MgCl21 mmol/L、CaCl21.8 mmol/L、NaH2PO40.33 mmol/L、葡萄糖10 mmol/L、Hepes 10 mmol/L，用NaOH調(diào)pH至6.8。無鈣缺血臺氏液除沒有CaCl2之外,其余成分與臺氏液相同。測鈣外液：Tris-Cl 136 mmol/L、CsCl 5.4 mmol/L、MgCl2·6H2O 1.0 mmol/L、CaCl2·H2O 2.0 mmol/L、NaH2PO40.33 mmol/L、葡萄糖 10 mmol/L、Hepes 10 mmol/L，用 Tris-OH調(diào)pH至 7.4。缺血測鈣外液Tris·Cl 136 mmol/L、CsCl 5.4 mmol/L、CaCl22.0 mmol/L、MgCl2·6H2O 1.0 mmol/L、Hepes 10 mmol/L、葡萄糖 5 mmol/L，用Tris·OH調(diào)至pH 6.8。測鈣內(nèi)液CsCl 20 mmol/L、MgCl2.6H2O 1 mmol/L、MgATP 5 mmol/L、EGTA 10 mmol/L、CsOH 110 mmol/L、天冬氨酸鹽110 mmol/L,用CsOH調(diào)至pH 7.2。

1.3方法

1.3.1大鼠心肌細(xì)胞急性分離[6]大鼠腹腔注射麻醉后迅速開胸取出心臟，快速游離主動脈并逆行插管連接于Langendorff 灌流裝置上。先用正常臺氏液連續(xù)灌流約3～5 min，心臟復(fù)跳后洗去心臟內(nèi)殘血。然后換用無鈣臺氏液以12 mL/min速度灌流大約20 min至心臟停止搏動后，換用含膠原酶Ⅱ和BSA的無鈣臺氏液繼續(xù)灌流消化膠原組織以獲得單個心肌細(xì)胞。當(dāng)心臟變軟、色澤變淺時，開始剪取少量心肌組織，每隔2 min剪取1次。將不同時間剪下的心肌組織置于裝有KB液的試管中，用吸管輕輕吹打，使單個心肌細(xì)胞從組織塊上分離下來。去除殘余的大塊組織后置于KB液中放到4 ℃冰箱穩(wěn)定1 h待用。

1.3.2全細(xì)胞膜片鉗電生理記錄[7]應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄單細(xì)胞離子電流。將分離好的單細(xì)胞置于浴槽中，待貼底壁后，用正常臺氏液以5 mL/min恒速灌流沖洗細(xì)胞至表面清潔，選擇靜止、桿狀、橫紋清晰、折光性良好的單個心肌細(xì)胞進(jìn)行封接實驗。電極接觸細(xì)胞并給予負(fù)壓使電極尖端和細(xì)胞膜間形成高阻封接(>10 GΩ)后用脈沖式負(fù)壓抽吸破膜，形成全細(xì)胞構(gòu)型，用電壓鉗模式下進(jìn)行刺激和記錄正常組(pH 7.4)、缺血組(pH 6.8)、膽堿組(pH 6.8，預(yù)敷1.0 mmol/L膽堿3 min)和4-DAMP組(pH 6.8，預(yù)敷5 nmol/L 4-DAMP 3 min后加入膽堿)的ICa-L。電極液和細(xì)胞外液之間的液接電位(10～11 mV)形成全細(xì)胞構(gòu)型前歸零。數(shù)據(jù)采集前進(jìn)行膜電容和串聯(lián)電阻補償，信號輸入經(jīng)過1 kHz的濾波，數(shù)據(jù)存于計算機硬盤以便分析。

1.3.3心肌細(xì)胞內(nèi)鈣測定[8]細(xì)胞穩(wěn)定好后，取鏡下觀察多數(shù)為桿狀且橫紋清晰無顆粒的細(xì)胞用于實驗，先棄去負(fù)載液，然后分別用無鈣液按體積比稀釋成1/8、1/4、1/2和1倍體積的含有BSA(100 mg/L)的正常臺氏液各敷鈣1次，每次10 min，然后放在37 ℃恒溫箱中用終濃度為5 μmol/L Fluo-3/AM染色30 min，1 000 r/min離心1 min去除染色液后，用有鈣液稀釋至所需的濃度(10倍物鏡視野中30～40個細(xì)胞)，加入預(yù)先粘有刀豆蛋白(0.25%)的浴槽中(250 μL)中貼壁，待用，所用正常臺氏液充O2飽和，缺血臺氏液不充氧。取染好色的細(xì)胞置于浴槽中，靜置貼壁5 min后，選取桿狀、橫紋清晰無顆粒的細(xì)胞進(jìn)行實驗。在激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為526 nm，在Time series程序下對細(xì)胞XY平面進(jìn)行掃描，間隔時間為10 s，共掃描30次，預(yù)掃描獲得基礎(chǔ)值后于第2和第3次掃描間隙之間加入30 mmol/L的KCl。給藥組孵育10 min后加KCl(30 mmol/L);對照組細(xì)胞直接加KCl(30 mmol/L) 。計算細(xì)胞XY平面內(nèi)平均熒光強度(Fi)，以Fi代表[Ca2+]i。以Fmax(給藥后最高熒光強度)與F0(給藥前熒光強度)的比值( Fmax/F0)代表[Ca2+]i的熒光強度變化。

2結(jié)果

2.1膽堿對缺血性心室肌細(xì)胞ICa-L的影響在形成全細(xì)胞封接狀態(tài)后，將細(xì)胞鉗制在-40 mV，以去除鈉電流的影響。測鈣內(nèi)外液均含CsCl，K+被Cs-所取代，以阻斷鉀電流[9]，命令電位從-30 mV～+50 mV，以10 mV為步階，波寬為300 ms，此時可記錄到內(nèi)向鈣電流。缺血組ICa-L電流密度(11.02±0.78)pA/pF，比正常組(5.12±0.15)pA/pF明顯升高(n=10，P<0.01)。膽堿組電流密度降至(7.52±0.39)pA/pF，明顯低于缺血組(n=6，P<0.01)，4-DAMP組ICa-L電流密度升至(±0.65)，與膽堿組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(n=6，P<0.01)，結(jié)果見圖1。

A：正常組;B：缺血組;C：膽堿組;D：4-DAMP組;E：各組心肌細(xì)胞ICa-L比較。*:P<0.05,**:P<0.01,與正常組比較；#：P<0.05，##：P<0.01，與缺血組比較；+：P<0.05，++：P<0.01，與膽堿組比較。

圖1M3受體激動劑膽堿對缺血心肌細(xì)胞ICa-L的影響

2.2膽堿對缺血性心室肌細(xì)胞鈣庫的影響利用激光掃描共聚焦技術(shù)觀察M3受體激動劑膽堿對缺血情況下心肌細(xì)胞鈣庫的影響。在無鈣液中，給予咖啡因后鈣Fmax/F0為4.21±0.12，預(yù)先給予1.0 mmol/L膽堿處理心肌細(xì)胞5 min后再用咖啡因激動，鈣Fmax/F0為4.02±0.27，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果見圖2。

A:咖啡因;B:膽堿。

圖2M3受體激動劑膽堿對缺血心肌細(xì)胞鈣庫

鈣釋放的影響

2.3膽堿對缺血性心室肌細(xì)胞[Ca2+]i的影響正常情況下，細(xì)胞內(nèi)鈣Fmax/F0為5.80±0.18。pH 6.8時，內(nèi)鈣升高幅度較大，F(xiàn)max/F0為9.13±0.32，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。預(yù)先給予1.0 mmol/L膽堿處理的心肌細(xì)胞內(nèi)鈣升高幅度不明顯，與缺血組(pH 6.8)相比，F(xiàn)max/F0為6.95±0.15，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。給予膽堿之前預(yù)先孵育M3受體阻斷劑4-DAMP 5 nmol/L，則可阻斷膽堿抑制細(xì)胞內(nèi)鈣升高的作用，鈣Fmax/F0為8.39±0.36，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，結(jié)果見圖3。

A:正常組;B:缺血組;C:膽堿組;D:4-DAMP組。*：P<0.01，與正常組比較;#：P<0.01，與缺血組比較;+：P<0.01，與膽堿組比較。

圖3M3受體激動劑膽堿對缺血性心室肌

細(xì)胞[Ca2+]i的影響

3討論

心肌缺血時交感神經(jīng)過度興奮，可造成心動過速，收縮力增強，心肌耗氧量增多，加重心臟血氧供需失衡。激動M3受體可以使心率減慢，心肌收縮力減弱，理論上可以減少心肌的耗氧量，對缺血心肌產(chǎn)生保護(hù)作用[10-11]。心肌細(xì)胞在缺血環(huán)境中內(nèi)鈣明顯升高，為缺血梗死后的典型損傷表現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，在缺血環(huán)境下M3受體激動劑膽堿可抑制心室肌細(xì)胞ICa-L及降低[Ca2+]i，從而抑制缺血時心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載發(fā)揮對缺血性心肌的保護(hù)作用。

筆者用低pH值(pH 6.8)乏氧液來模擬缺血環(huán)境[12-13]，在pH 6.8情況下，ICa-L明顯增加，膽堿可明顯降低ICa-L，減少缺血時的外鈣內(nèi)流，此作用可以被M3受體阻斷劑4-DAMP[14]阻斷，證明膽堿可通過激動M3受體抑制外鈣內(nèi)流，從而降低心肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣水平。

心肌組織內(nèi)鈣升高的主要來源為細(xì)胞內(nèi)的鈣庫?？Х纫蚴羌?xì)胞鈣庫激動劑，可同時激動Ryanodine受體和IP3受體[15]。在無鈣液中，給予咖啡因可觀測到細(xì)胞內(nèi)鈣庫的鈣釋放。本研究顯示，膽堿對于缺血情況下的鈣庫釋放沒有抑制作用，提示膽堿抑制缺血引起的內(nèi)鈣超載與鈣庫無直接關(guān)系，膽堿并不能直接影響鈣庫的釋放功能。

為了更明確地證實膽堿降低缺血細(xì)胞內(nèi)鈣的作用，應(yīng)用激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，低濃度膽堿(1.0 mmol/L)可抑制缺血引起的內(nèi)鈣超載現(xiàn)象，降低缺血細(xì)胞[Ca2+]i。預(yù)先孵育4-DAMP可大部分逆轉(zhuǎn)膽堿降低缺血細(xì)胞[Ca2+]i的作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，進(jìn)一步證實膽堿抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載，參與缺血心肌的保護(hù)作用的主要原因是激動M3受體。

綜上所述，膽堿對于缺血性心肌的保護(hù)作用是通過激動M3受體抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載實現(xiàn)的。在酸中毒(pH 6.8)情況下，細(xì)胞內(nèi)鈣明顯超載，給予M3受體激動劑膽堿治療，可抑制缺血心肌細(xì)胞ICa-L，降低外鈣內(nèi)流，從而抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載，發(fā)揮抗心肌保護(hù)的作用。為進(jìn)一步明確M3受體影響細(xì)胞內(nèi)鈣超載的作用機制，還需要探索其對鈉鈣交換體、Ryanodine受體及三磷酸肌醇受體的影響，對心肌的保護(hù)作用做深層次的驗證。

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Protective effects of choline on myocardial ischemic rat heart and its potential mechanisms*

Luan Hairong,Sun Jian,Wang Deli,Li Li,Wu Hong△

(DepartmentofFunctionalMedicine,MudanjiangMedicalCollege/KeyLaboratoryofCancerPreventionandTreatmentofHeilongjiangProvince,Mudanjiang,Helongjiang157011,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the protective effects of choline on myocardial ischemia rat heart and its potential mechanisms.MethodsIschemia hypoxia environment was simulated with low value of pH (pH 6.8) and lack of oxygen.Calcium currents were recorded by whole cell patch under the voltage clamp configuration.The alternations in[Ca2+]induced by KCl was detected by laser scanning confocal microscope in ventricular myocytes,then disccuss the effects of choline on calcium and calcium store in cells.ResultsThe normalized peak currents ofICa-Lin ventricular myocytes were larger in pH 6.8 group than those in pH 7.4 group,which can be attenuated by choline.The(Ca2+)i induced by KCl in ventricular myocytes were significantly increased in pH 6.8 Tyrode solution and its increasing can be suppressed by choline.4-DAMP can inhibit the suppressing effect of choline.ConclusionThe possible mechanism of M3receptor involved in the protection of ischemic myocardium by inhibiting myocardial cells inICa-L,inhibiting intracellular calcium overload.

[Key words]myocardial ischemia;choline;ICa-L;patch clamp technique;laser scanning confocal microscope

doi:·論著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.17.001

*基金資助項目： 國家自然科學(xué)基金青年基金資助項目(81300163);黑龍江省教育廳科研課題(12531731);牡丹江醫(yī)學(xué)院科學(xué)技術(shù)研究項目(ZS201321)。

作者簡介：欒海蓉(1978-)，講師，碩士，主要從事心血管藥理學(xué)方面研究?！魍ㄓ嵶髡撸琓el:13820404677；E-mail:whmed@126.com。

[中圖分類號]R331.31

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)17-2305-03

(收稿日期：2015-11-25修回日期：2016-01-11)