申小年 彭俊宇 戴儉華

摘? 要：目的? 分別用NaV1.7離子通道測(cè)試的常用中藥的抑制率，比較這些常用藥物的療效，為臨床處方治療疼痛提供理論指導(dǎo)。方法? 選擇三七、天麻、全蝎、蘄蛇各20 g，根據(jù)2015版中藥藥典通則2201的40 g對(duì)應(yīng)1 000 mL水的方法，冷凝水煎提取。然后過(guò)0.22 μm濾膜，使用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，研究這些藥物分別對(duì)NaV1.7離子通道抑制作用。結(jié)果? 抑制率的比較的結(jié)果：三七的抑制率最高，臨床有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 對(duì)于臨床骨科常用藥物止痛效果有一定的指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：疼痛? 膜片鉗? 離子通道? 中藥鎮(zhèn)痛

中圖分類號(hào)：R73??????????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ???????????? 文章編號(hào)：1672-3791（2021）01（a）-0250-03

Comparison of Inhibition Rates of Different Traditional Chinese Medicine on Nav1.7 Ion Channel

SHEN Xiaonian1? PENG Junyu2? DAI Jianhua2

（1.Anhui College of Traditional Chinese Medicine; 2. Anhui Wuhu Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Anhui College of Traditional Chinese Medicine， Wuhu， Anhui Province， 241000 China）

Abstract： Objective The inhibition rates of commonly used traditional Chinese medicines tested with NaV1.7 ion channels were compared， and the therapeutic effects of these commonly used medicines were compared to provide theoretical guidance for the clinical prescription of pain. Methods 20 g each of Panax notoginseng， Gastrodia elata， whole scorpion， and cypris were selected. According to the method of 2015 edition of the General Principles of Chinese Medicine Pharmacopoeia 2201， 40 g corresponded to 1 000 mL of water，condensate decoction extraction. Then through a 0.22 μm filter， using whole-cell patch-clamp technology to study the inhibitory effects of these drugs on NaV1.7 ion channels. Results? The result of the comparison of the inhibition rate： Panax notoginseng has the highest inhibition rate， which is statistically significant. Conclusion It has certain guiding significance for the analgesic effect of commonly used drugs in clinical orthopedics.

Key Words： Pain; Patch clamp; Ion channel; Analgesia with traditional Chinese medicine

疼痛是一種在軀體或內(nèi)臟組織中產(chǎn)生的具有潛在傷害性或受到有害刺激之后的令人不快的感覺(jué)。炎癥和神經(jīng)性疼痛與急性疼痛不同，如關(guān)節(jié)炎和偏頭痛，在大部分人身上往往表現(xiàn)出的是持久的慢性狀態(tài)，醫(yī)療保健費(fèi)用花費(fèi)達(dá)數(shù)十億美金并且造成生產(chǎn)力損失[1]。鈉離子通道的表達(dá)異?？赡芘c炎性痛、神經(jīng)病理性痛和癌痛等多種慢性痛的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[2]。電壓門(mén)控鈉通道是完整的跨膜蛋白，為興奮性細(xì)胞的快速去極化提供電流通路，并且它們?cè)趥鬟f傷害感受器對(duì)背角突觸的反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[3]。NaV1.7離子通道主要集中分布于感覺(jué)神經(jīng)的背根神經(jīng)節(jié)和交感神經(jīng)的神經(jīng)節(jié)中，同時(shí)也分布于傷害性刺激密切相關(guān)的傳入神經(jīng)纖維Aβ纖維和C纖維中表達(dá)[4]。

近年來(lái)，基于幾項(xiàng)顯著的人類遺傳學(xué)研究，NaV1.7已成為一種極有研究?jī)r(jià)值的鎮(zhèn)痛靶點(diǎn)。調(diào)控編碼NaV1.7α亞基基因?yàn)镾CN9A，研究指出SCN9A基因不同位點(diǎn)突變導(dǎo)致了疼痛相關(guān)疾病的發(fā)生：如紅斑性肢痛癥（Inherited Erythro Melalgia，IEM）、先天性無(wú)痛癥（Congenital Insensitivity to Pain，CIP）和陣發(fā)性劇痛癥（Paroxysmal Extreme Pain Disorder，PEPD）。特異性NaV1.7阻斷劑是當(dāng)前靶向鈉通道的鎮(zhèn)痛藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。

藥物治療為神經(jīng)病理性疼痛的主要治療方案之一，但不良反應(yīng)使其在臨床應(yīng)用中受到一定限制。因此尋找新的藥物治療思路顯得尤為重要。臨床上中醫(yī)藥的止痛使用范圍極為廣泛，但是一直沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一的檢測(cè)衡量標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)該實(shí)驗(yàn)希望能夠建立一種檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)使中藥止痛的療效有一個(gè)比較，指導(dǎo)臨床使用中藥。

1? 材料和方法

1.1 水提液的制備

精密稱量三七、天麻、全蝎、蘄蛇各20 g，濃度按40 g藥物/1 000 mL超蒸水進(jìn)行提取，冷浸60 min，在115 ℃下冷凝提取，熱煮沸60 min，濃縮液約為500 mL。將液袋封放置于冰箱在-20 ℃下儲(chǔ)存冷藏室待用。用時(shí)用濾網(wǎng)（0.22 μm）的濾器儲(chǔ)備溶液濃度分別為0.1 g/mL和0.25 g/mL。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

NaV1.7通道穩(wěn)定表達(dá)在人胚腎（HEK 293）細(xì)胞上，NaV1.7通道（山東維真生物醫(yī)藥科技有限公司，濟(jì)南，中國(guó)）分別生長(zhǎng)于DMEM（DMEM，Gibco，USA），100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素和400 μg/mL G418（Sigma-Aldrich，USA）的培養(yǎng)基，且放置在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。用胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，然后在膜片鉗實(shí)驗(yàn)前將細(xì)胞接種在無(wú)菌玻璃蓋玻片上12～36 h。

1.3 全細(xì)胞膜片鉗記錄

用于NaV通道記錄的標(biāo)準(zhǔn)浴液包含：70 mM NaCl、1 mM MgCl2、4 mM CsCl、10 mM葡萄糖、10 mM HEPES、1.8 mM CaCl2、用NaOH將pH調(diào)節(jié)至7.4，用蔗糖將摩爾滲透壓濃度調(diào)節(jié)至300 mOsm。用于NaV通道記錄的標(biāo)準(zhǔn)電極內(nèi)液包含40 mM CsCl、100 mM CsF、2 mM MgCl2、5 mM EGTA、10 mM HEPES，用CsOH將pH調(diào)節(jié)至7.4，用蔗糖將溶液摩爾滲透壓濃度調(diào)節(jié)至300 mOsm。

2? 數(shù)據(jù)分析

使用Clampfit（Axon，USA）軟件對(duì)電流進(jìn)行分析。通過(guò)使用非線性回歸方程分析擬合到模式方程的數(shù)據(jù)（SSPS）。組數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（），使用單樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Fig.1.抑制率比較：抑制率均值單樣本t檢驗(yàn)，（P=0.018），P<0.05。抑制率的比較的結(jié)果：三七的抑制率最高，臨床有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三七對(duì)NaV1.7離子通道的抑制率比天麻、全蝎、蘄蛇更有效。

3? 討論

神經(jīng)病理性疼痛的病理生理機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)代研究認(rèn)為主要是外周敏化（Peripheral Sensitization）和中樞敏化（Central Sensitization）引起疼痛?，F(xiàn)在對(duì)于神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制主要是通過(guò)動(dòng)物模型進(jìn)行研究。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為理解人類神經(jīng)病理性疼痛提供了非常有價(jià)值的工具。常見(jiàn)的動(dòng)物模型有坐骨神經(jīng)慢性壓迫（Chronic Constriction Injury， CCI）模型、坐骨神經(jīng)分支選擇損傷（Spared Nerve Injury， SNI）模型、背根神經(jīng)節(jié)慢性壓迫（Chronic Compression of Dorsal Root Ganglion， CCD）模型、坐骨神經(jīng)部分結(jié)扎（Partial Sciatic Nerve Injury， PSNI）模型、脊神經(jīng)結(jié)扎（Spinal Nerve Ligation， SNL）模型。這些動(dòng)物模型可表現(xiàn)痛覺(jué)過(guò)敏、痛覺(jué)異常以及自發(fā)痛等NP癥狀，主要通過(guò)機(jī)械刺激痛、熱刺激痛和冷刺激痛確定模型是否成功。電壓門(mén)控鈉（NaV）通道是完整的跨膜蛋白，為可興奮細(xì)胞的快速去極化提供電流通路，并且它們?cè)趥鬟f傷害感受器對(duì)背角突觸的反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。特異性NaV1.7阻斷劑是當(dāng)前靶向鈉通道的鎮(zhèn)痛藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。通過(guò)該研究發(fā)現(xiàn)，三七在這幾味中藥中對(duì)NaV1.7離子通道抑制率最高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;表明三七比天麻、全蝎和蘄蛇在疼痛的止痛方面更有效果;進(jìn)一步解釋了三七止痛是抑制了對(duì)NaV1.7離子通道的抑制，提供了臨床三七止痛的藥理基礎(chǔ)。還需要進(jìn)一步研究三七止痛的主要成份和量效關(guān)系。

參考文獻(xiàn)

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[3]?Ednard Emery， Ana Paula Luiz， John N Wood. Nav1.7 and other voltage-gated sodium channels as drug targets for pain relief[J].Expert Opin Ther Targets，2016，20（8）：975-983.

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[5]?岳子皓.糖皮質(zhì)激素受體調(diào)節(jié)鈉離子通道Nav1.7參與神經(jīng)病理性疼痛[D].鄭州大學(xué)，2016.

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