曹麗梅，趙萱*，劉婷婷，唐敏，李茜，潘媛，傅超美

·炮制制劑·

HPLC法同時(shí)測(cè)定參附注射液中五種人參皂苷的含量

曹麗梅，趙萱*，劉婷婷，唐敏，李茜，潘媛，傅超美

目的：建立同時(shí)測(cè)定參附注射液中人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd 5種主要皂苷成分含量測(cè)定高效液相色譜法。方法：采用Agilent ZORBAX SB-C18柱（ 4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為乙腈（B）-水(A)二元梯度洗脫；在203 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果：表明人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd分別在31.72～158.60、11.43～57.15、129.87～649.35、117.30～586.50、18.71～93.55 μg·mL-1線(xiàn)性范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好（相關(guān)系數(shù)均大于0.995），平均加樣回收率分別為98.28%、98.14%、99.40%、96.80%、98.63%。結(jié)論：同時(shí)測(cè)定參附注射液中上述5種成分，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、分離度好、重現(xiàn)性好，可用于參附注射液的質(zhì)量控制；采用此種多成分、多指標(biāo)評(píng)價(jià)中藥注射劑的方法，更能體現(xiàn)產(chǎn)品的活性成分群及功能主治，控制產(chǎn)品有效性。

參附注射液；HPLC法；人參皂苷Rg1；人參皂苷Re；人參皂苷Rb1；人參皂苷Rc；人參皂苷Rd

自上個(gè)世紀(jì)30年代柴胡注射液首次問(wèn)世以來(lái)，注射劑已經(jīng)過(guò)八十多年的臨床應(yīng)用，取得了一系列令人矚目的成績(jī)，形成了“理論可靠、制劑有道、臨床顯效”的科學(xué)體系，尤其是中藥注射液在治療危、急重癥及慢性疾病方面的特殊優(yōu)勢(shì)，使得中藥注射液在現(xiàn)代中醫(yī)藥領(lǐng)域具有無(wú)可替代的地位。參附注射液源自七百年之古驗(yàn)方參附湯，是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，結(jié)合“整體活性、去雜存精”制劑原則和“直入血分、速效救急”臨床應(yīng)用的成功劑型改革典范。參附注射液臨床應(yīng)用劑量安全范圍寬、毒副作用小，被廣泛用于肺源性心力衰竭[1]、冠心病慢性心力衰竭[2]、充血性心力衰竭[3]、急性心力衰竭[4]的治療，并取得了顯著療效。此外也抗休克[5]，對(duì)缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[6]。

中藥注射劑具有多成分、多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的綜合作用和整體效應(yīng)。有學(xué)者采用“譜-效結(jié)合”方法研究參附注射液的化學(xué)成分，分離出于抗溶血作用有關(guān)的20種人參皂苷和6種烏頭類(lèi)生物堿，而目前多只以人參皂苷Rb1作為衡量制劑質(zhì)量的指標(biāo)[7]，難以體現(xiàn)中藥復(fù)方注射液組方中“藥有個(gè)性之特長(zhǎng)，方有合群之妙用”的物質(zhì)基礎(chǔ)之“活性成分群”。另有文獻(xiàn)報(bào)道謝華等采用高效液相法測(cè)定參附注射液中人參皂苷僅Rg1和Re兩個(gè)成分的含量[8]。本試驗(yàn)選擇參附注射液中5種主要皂苷類(lèi)成分作為參附注射液中紅參含量測(cè)定的指標(biāo)成分，建立了快速同時(shí)測(cè)定5種皂苷成分的HPLC含量測(cè)定方法，對(duì)建立參附注射液更完善的質(zhì)量控制體系有一定的科學(xué)的參考價(jià)值。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀（包括四元梯度泵單元、自動(dòng)脫氣單元、自動(dòng)控溫進(jìn)樣單元、DAD多波長(zhǎng)檢測(cè)器單元和Chem Station 色譜工作站等)。色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱（ 4.6 mm×150 mm，5 μm），美國(guó)Agilent Techologies 公司；CP225D型和BS210S型電子天平，德國(guó)Sartorius公司；KH—300DB型數(shù)控超聲儀，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司

1.2 試藥

對(duì)照品人參皂苷Rg1（批號(hào)：MUST-16022407）、人參皂苷Re（MUST-16012701）、人參皂苷Rb1（MUST-16021907）購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所；對(duì)照品人參皂苷Rc（PS160414-05）、人參皂苷Rd（PS10051301）購(gòu)于成都市普思生物科技有限公司，所有對(duì)照品經(jīng)HPLC峰面積歸一化法檢測(cè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在98%以上。乙腈為色譜純，水為去離子水，其他試劑均為分析純。參附注射液（批號(hào)：15110701004、150914010、150912010，10 ml/支）購(gòu)于雅安三九藥業(yè)股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相色譜法測(cè)定參附注射液中5種有效成分含量

2.1.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18柱（ 4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為乙腈，二元梯度洗脫程序?yàn)椋?-25 min,20%-20%B；25-30 min,20%-30%B；30-45 min,30%-40%B；45-50 min,40%-19%B。體積流量1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10μL。對(duì)照品1、SF Injection 2色譜圖。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd對(duì)照品適量，以甲醇溶解并定容，搖勻，制成適宜質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，置冰箱備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 取參附注射液適量，過(guò)0.22 μm的微孔濾膜，既得。

圖A 對(duì)照品圖譜 (t/min)

圖B 參附注射液樣品圖譜 (t/min)1.人參皂苷Rg12. 人參皂苷 Re 3. 人參皂苷Rb1

2.1.4 系統(tǒng)適應(yīng)性及專(zhuān)屬性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液及SFI10 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，拖尾因子均在在0.97～1.03范圍內(nèi)，理論塔板數(shù)以各色譜峰計(jì)算均在6000以上，方法專(zhuān)屬性良好。

2.1.5 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密稱(chēng)取人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd對(duì)照品適量，以甲醇溶解并定容，搖勻，配制成一系列不同質(zhì)量濃度的5種混合對(duì)照品溶液。Rg1的質(zhì)量濃度為31.72、63.44、95.16、126.88、158.60 μg·mL-1；Re的質(zhì)量濃度為11.43、22.86、34.29、45.72、57.15 μg·mL-1；Rb1的質(zhì)量濃度為129.87、259.74、389.61、519.48、649.35 μg·mL-1；Rc的質(zhì)量濃度為117.30、234.60、351.90、469.20、586.50 μg·mL-1；Rd的質(zhì)量濃度為18.71、37.42、56.13、74.84、93.55 μg·mL-1。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣量10 μL，記錄色譜圖。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到回歸方程、相關(guān)系數(shù)（γ）和線(xiàn)性范圍，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 5種成分的回歸方程和線(xiàn)性關(guān)系考察

2.1.6 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μl，按“2.1.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測(cè)，記錄各組色譜峰峰面積。結(jié)果人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc及Rd峰面積的RSD分別為1.21%、1.26%、1.31%、1.19%、1.33%。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同批次參附注射液，按2.1.3項(xiàng)下供試拼溶液的制備方法，制成6份供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算各物質(zhì)的質(zhì)量濃度，人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc及Rd的平均質(zhì)量濃度分別為51.73、22.33、156.85、140.36、34.38 μg.mL-1，RSD分別為1.18%、1.47%、1.86%、1.59%、1.30%。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 參附注射液，室溫放置，分別于制備后0、1、2、3、6、12、24 h注入高效液相色譜儀，按“2.1.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc及Rd的峰面積，RSD分別為0.42%、0.73%、0.23%、0.82%、0.51%；試驗(yàn)結(jié)果表明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取適量的對(duì)照品,甲醇溶解,定容,搖勻,制備成質(zhì)量濃度與已測(cè)定參附注射液（批號(hào)：5110701001）相近的混合對(duì)照品溶液.分別精密量取0.12、0.20、0.28 mL的參附注射液與混合對(duì)照品溶液，制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算平均回收率。

表2 參附注射液的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.2 參附注射液樣品測(cè)定

取3批樣品，分別制備供試品溶液，按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定3次，記錄各色譜峰的峰面積。計(jì)算3批參附注射液中人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd五種皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表 3 參附注射液中5種人參皂苷成分測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

影響中藥注射劑安全與有效性的因素很多，最主要的環(huán)節(jié)是注射劑的制備工藝，而中藥注射劑的活性成分具有多成分，多靶點(diǎn)，多作用的特點(diǎn)，通過(guò)復(fù)方中多種有效成分的相互協(xié)調(diào)作用，發(fā)揮其更好的臨床療效。所以應(yīng)盡可能選擇多成分、多指標(biāo)評(píng)價(jià)產(chǎn)品的質(zhì)量，以保證參附注射劑的臨床療效。本試驗(yàn)首次建立HPLC同時(shí)測(cè)定參附注射液中Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd 5種主要人參皂苷含量的測(cè)定方法。試驗(yàn)過(guò)程中，還比較了202 nm波長(zhǎng)和203 nm波長(zhǎng)對(duì)皂苷含量的影響，結(jié)果表明5種皂苷均在203 nm處有最大吸收，受雜質(zhì)的影響甚微，且基線(xiàn)平穩(wěn)，準(zhǔn)確度高。通過(guò)比較Agilent ZORBAX SB-C18柱（ 4.6 mm×150 mm，5 μm）和Agilent Elispe XDS- C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），采用水-乙腈二元梯度洗脫，試驗(yàn)結(jié)果表明Agilent ZORBAX SB-C18柱（ 4.6 mm×150 mm，5 μm）分離效果更好，分離時(shí)間短。

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(責(zé)任編輯：傅舒)

Simultaneous determination of fve components in School of pharnacy, Shenfu injection with HPLC method

/CAO Li-mei, ZHAO Xuan,LIU Ting-ting, TANG Min, LI Qian, PAN Yuan, FU Chao-mei //(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective: To establish the method for simultaneous determination of ginsenoside Rg1, ginsenoside Re, ginsenoside Rb1, ginsenoside Rc, ginsenoside Rd in Shenfu injection by HPLC. Method: Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150mm，5μm) column was used in detection with a gradient mobile phase system consisting of water and acetonitrile. The wavelength of DAD detector was set at 203nm for analytes detection. Result: The results shows that ginsenoside Rg1, ginsenoside Re, ginsenoside Rb1, ginsenoside Rc, ginsenoside Rd have a good correlation among linear ranges of 31.72～158.60, 11.43～57.15, 129.87～649.35, 117.30～586.50, 18.71～93.55 μg·mL-1, respectively(γ＞0.9995). The average recovery was 98.28%, 98.14%, 99.40%, 96.80%, 98.63% respectively. Conclusion: This method can be used as a quantitative analysis for Shenfu Injection content determination.

Shenfu injection ; HPLC; ginsenoside Rg1; ginsenoside Re; ginsenoside Rb1; ginsenoside Rc; ginsenoside Rd

R285.5

A

1674-926X(2016)06-006-03

國(guó)家自然科學(xué)基金委青年基金項(xiàng)目編號(hào)（81503266）

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 611137;

曹麗梅（1991-），碩士研究生，從事中藥新制劑、新技術(shù)與新工藝研究 Email:410501297@qq.com

趙萱（1986-），碩士，講師，從事中藥新制劑、新技術(shù)與新工藝研究 Email:626098860@qq.com

2016-05-10