陳丹丹，彭成，謝曉芳，劉莟，潘媛

·藥理毒理·

氫溴酸樟柳堿預防給藥對急性腦缺血再灌注損傷大鼠的保護作用研究

陳丹丹1,2，彭成1，謝曉芳1，劉莟1，潘媛1

目的：觀察氫溴酸樟柳堿預防給藥對急性腦缺血再灌注損傷大鼠的保護作用。方法：采用大鼠大腦中動脈栓塞法制備急性腦缺血再灌注損傷大鼠模型，觀察預防給藥對缺血再灌注大鼠行為學評分、腦梗死面積、腦含水量以及血清NO、NOS、Ach、AchE的影響。結(jié)果：與模型動物比較，氫溴酸樟柳堿在預防給藥小劑量下對神經(jīng)行為學評分有明顯改善，在腦梗死面積、腦水腫、NOS、NO方面小劑量組也都表現(xiàn)出改善趨勢，大劑量組在腦行為學方面、腦梗死面積、NOS及Ach方面表現(xiàn)出改善趨勢。結(jié)論：氫溴酸樟柳堿預防給藥對急性腦缺血再灌注損傷大鼠有一定的保護作用。

氫溴酸樟柳堿；急性腦缺血再灌注損傷；NOS ；Ach

缺血性腦卒中（cerebral ischemic stroke,CIS）又稱腦梗死（cerebral infarction，CI），是最常見的卒中類型，約占腦血管疾病總數(shù)的60%-80%，是指由于腦部血液供應障礙，缺血、缺氧引起的局限性腦組織的缺血性壞死或腦軟化[1]。

樟柳堿是從茄科植物唐古特山莨菪根中提取出的一種生物堿，氫溴酸樟柳堿為其氫溴酸鹽。查閱文獻資料發(fā)現(xiàn)：多年來學界對其化學特性、藥理作用和臨床應用等方面進行了相關(guān)研究，特別是在化學特性及眼科臨床應用的研究報道較多。但由于國家政策導向、及本品的特性等原因，致使對其研究呈一定的歷史階段性。研究資料顯示，樟柳堿化學結(jié)構(gòu)和東莨菪堿、山莨菪堿、阿托品等莨菪烷類生物堿相似[2]。早期研究資料也顯示出樟柳堿可使電灼閉塞錐動脈并夾閉/打開頸動脈法所建立大鼠急性腦缺血再灌注損傷模型異常升高的前腦鈣含量和伊文思藍含量明顯降低，減少腦組織水腫[3]，然而目前關(guān)于樟柳堿的研究文獻較陳舊，藥理作用的研究報道集中于20世紀八九十年代，對其用藥劑量不確定，藥理作用機制揭示不充分，藥理與臨床研究方法都相對較落后，不良反應的防治不是很清楚，這些方面均有待進一步研究和評價，以更好地指導臨床用藥。

本研究擬采用線栓法制作急性大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型（MCAO），采用氫溴酸樟柳堿預防給藥的方式，考察氫溴酸樟柳堿抗急性腦缺血再灌注損傷作用。

1 實驗材料

1.1 實驗藥物

氫溴酸樟柳堿，由成都第一藥業(yè)有限公司提供，批號140903。陽性藥物為尼莫地平注射液（規(guī)格為50 mL:10 mg），由拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司生產(chǎn)，批號BXGVZ71。

1.2 實驗動物

SD大鼠，SPF級，雄性，體重（300±20）g，四川省中醫(yī)藥科學院實驗動物中心提供，質(zhì)量合格證號:SCXK(川)2013-19。

1.3 主要試劑

水合氯醛，成都市科龍化工試劑廠，批號2015090602； 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC），sigma公司，批號LotBCBP3272V；大鼠血清NO試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號20151113；NOS試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號20151104；大鼠乙酰膽堿（Ach）酶聯(lián)免疫分析試劑盒、乙酰膽堿酯酶（AchE）酶聯(lián)免疫試劑盒，美國R﹠D公司,批號Lot 201511。

1.4 主要儀器

FA2004B型電子天平，上海越平科學儀器有限公司生產(chǎn)；TDZ4A-WS臺式低速離心機，湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司生產(chǎn)；Enspire多標記微孔板檢測儀，珀金埃爾默新加坡有限公司生產(chǎn)；DZKW-5-8電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司生產(chǎn)；DV1G-9070B智能型電熱恒溫鼓風干燥箱，上?，槴\實驗設備有限公司生產(chǎn)；EPED-E2-30TJ實驗室級超純水器，南京易普達科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)等。

2 實驗方法

大鼠購回后適應性飼養(yǎng)5 d，于第6 d按體重分組并尾靜脈注射對應藥物：假手術(shù)組和模型組（均注射生理鹽水）、陽性對照組（尼莫地平，1 mg· kg-1）、氫溴酸樟柳堿大劑量組(1.2 mg·kg-1)、氫溴酸樟柳堿小劑量組(0.3 mg·kg-1),連續(xù)注射三天。于最后一次注射后半小時，采用線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型，具體方法參照Zea Longa[4]方法加以改進：術(shù)前將大鼠禁食12 h，自由飲水，然后用10%水合氯醛350 mg·kg-1腹腔注射麻醉，待翻正反射消失后，仰臥位固定，剪去頸部被毛，消毒，頸正中切口，于氣管左側(cè)找到頸總動脈（CCA），結(jié)扎CCA近心端、遠心端被線，再分離頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA），結(jié)扎ECA，在ICA遠端放置動脈夾, CCA切口,沿切口插人直徑為 0.286 mm、頭端打磨光滑的標記魚線，魚線向ICA插入20 mm栓線進入ICA,穿過大腦中動脈(MCA)起始端至大腦前動脈(ACA)近端，固定栓線，完全阻斷大腦中動脈血供。缺血時間為2 h，再灌注時輕柔回抽魚線10 mm。術(shù)中和術(shù)后保持室溫 25℃左右，用白熾燈照動物使其肛溫維持在(37±1)℃，直到恢復活動。模型成功的標志：(1)左側(cè)Horner征；(2)右側(cè)出現(xiàn)以前肢為重的偏癱。假手術(shù)組除不插入魚線外，其余操作同模型組。

2.1 神經(jīng)行為缺陷的評分方法

大鼠在腦缺血 2 h再灌注 22 h后，按照Zea Longa[4]的五分制評分標準進行分級評分：無明顯神經(jīng)損傷癥狀0分；不能完全伸展對側(cè)前爪1分；向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈2分；向?qū)?cè)傾倒3分；不能自發(fā)行走，意識喪失4分。選擇神經(jīng)功能評分在1分及以上者(即造模成功者)進行后續(xù)實驗。取腦時如發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血的大鼠則被剔除不予實驗。

2.2 腦梗塞范圍及腦組織含水量的測定[5]

大鼠在腦缺血2 h再灌注22 h后，斷頭取腦剔除嗅腦、低位腦干及小腦，稱重后將腦組織做冠狀切片，厚度為2 mm左右，然后立即置于2%的TTC(0.01 mol·L-1PBS配置)溶液當中，37℃避光孵育30 min，期間每15 min翻動一次。經(jīng)染色后，正常腦組織呈玫瑰紅色，而腦梗塞區(qū)呈白色，將白色組織仔細分離，分別稱重，以梗塞區(qū)腦質(zhì)量與總切片腦質(zhì)量的百分比作為梗塞范圍。將染色后的腦組織置于105℃烤箱48 h烘干至恒重，對照大腦濕重按下述公式求出腦組織含水量：腦組織含水量 (%)=(1-腦組織干重／腦組織濕重 )×100% 。

2.3 生化指標檢測方法

造模成功大鼠,于再灌注22 h后,股動脈采血，3500 rpm離心，取血清按試劑盒說明書測定血清NO、NOS、Ach、AchE。

2.4 統(tǒng)計方法

所有結(jié)果均采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包建立實驗結(jié)果數(shù)據(jù)庫并進行one-way ANOVA 分析，以(x±s)表示各定量指標的平均值和分散程度。

3 實驗結(jié)果

3.1 氫溴酸樟柳堿對缺血再灌注大鼠神經(jīng)行為學評分、腦梗死面積及腦含水量的影響

由表1可知，在神經(jīng)行為學評分方面：假手術(shù)組動物無明顯神經(jīng)功能缺損，評分均為0；其余缺血組動物均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損，表現(xiàn)為同側(cè)horner征，病灶對側(cè)前爪內(nèi)收不能完全伸展，向右側(cè)轉(zhuǎn)圈等。氫溴酸樟柳堿小劑量組的神經(jīng)行為學評分與模型組相比，有一定的改善，具有統(tǒng)計學意義，p＜0.05；大劑量組表現(xiàn)出改善神經(jīng)行為學評分的趨勢。在腦梗死面積方面：假手術(shù)組動物無腦梗死癥狀，評分為0，模型動物缺血側(cè)腦組織梗死面積明顯，氫溴酸樟柳堿各劑量組表現(xiàn)出減少缺血側(cè)梗死面積的趨勢，但無統(tǒng)計學意義。在腦組織含水量方面：模型動物腦組織的含水量與假手術(shù)組相比，明顯增高，p＜0.01，氫溴酸樟柳堿小劑量組表現(xiàn)出降低腦組織含水量的趨勢。

表1 氫溴酸樟柳堿對缺血再灌注大鼠神經(jīng)行為學評分、腦梗死面積及腦含水量的影響（±s）

表1 氫溴酸樟柳堿對缺血再灌注大鼠神經(jīng)行為學評分、腦梗死面積及腦含水量的影響（±s）

注：與假手術(shù)組比較，▲▲P＜0.01，▲P＜0.05；與模型組比較，* P＜0.05，**P＜0.01

組別 動物數(shù) 行為學評分 梗死面積（%）腦組織含水量（%）假手術(shù)組 8 0±0 0±0 78.52±0.07模型組 8 1.25±0.46▲▲17.28±4.92▲▲80.08±0.55▲▲陽性對照組 8 0.38±0.52**6.88±7.20** 79.98±1.18氫溴酸樟柳堿大劑量組 8 0.75±0.46 13.89±3.77 81.20±0.45氫溴酸樟柳堿小劑量組 8 0.63±0.52* 14.89±7.76 79.65±0.23

3.2 氫溴酸樟柳堿對缺血再灌注大鼠血清NO,NOS的影響

由表2可知：與假手術(shù)組相比，模型動物血清NOS明顯增高，氫溴酸樟柳堿各劑量組有降低血清NOS的趨勢，小劑量組還表現(xiàn)出降低血清NO的趨勢。

表2 氫溴酸樟柳堿對缺血再灌注大鼠血清NO,NOS的影響(x±s)

3.3 氫溴酸樟柳堿對缺血再灌注大鼠血清Ach、AchE的影響

由表3可知：氫溴酸樟柳堿大劑量組表現(xiàn)出增加血清Ach的趨勢，兩個劑量組都表現(xiàn)出降低AchE的趨勢。

表3 氫溴酸樟柳堿對缺血再灌注大鼠血清Ach、AchE含量的影響(±s)

表3 氫溴酸樟柳堿對缺血再灌注大鼠血清Ach、AchE含量的影響(±s)

注：與假手術(shù)組比較，▲▲P＜0.01，▲P＜0.05；與模型組比較，* P＜0.05，**P＜0.01

組別 動物數(shù) Ach(pmol/L) AchE(U/L)假手術(shù)組 8 478.50±84.01 276.38±25.48模型組 8 465.08±60.84 268.54±39.65陽性對照組 8 541.80±48.27* 244.61±87.60氫溴酸樟柳堿大劑量組 8 477.72±51.19 256.92±66.76氫溴酸樟柳堿小劑量組 8 449.15±95.29 205.75±98.09

4 討論

缺血性腦卒中的易發(fā)部位在大腦中動脈,該動脈的閉塞形成局灶性腦缺血。因此大鼠MCAO（middle cerebral artery occlusion）模型是公認的研究腦缺血損傷的標準動物模型。相比之下，線栓法局灶性腦缺血模型具有無需開顱、創(chuàng)傷小、不需要特殊設備、缺血區(qū)部位較恒定等特點為臨床首選[6]，該模型也很好的模擬了臨床上溶栓治療后的血管再通過程,更貼近于臨床表現(xiàn)，故而本研究采用此模型。本研究從模型動物的行為學評分、腦梗死面積、腦組織含水量及部分生化指標來評價，模型動物與假手術(shù)動物都有顯著差異，表明造模成功。

從實驗結(jié)果可以看出，氫溴酸樟柳堿預防給藥對缺血再灌注大鼠的行為學評分有明顯的改善，在腦梗死面積、腦組織含水量及NOS、NO及Ach方面也有一定的改善趨勢，以及表現(xiàn)出降低AchE的趨勢。目前的研究普遍認為腦缺血時膽堿能系統(tǒng)出現(xiàn)障礙，表現(xiàn)出Ach的減少及AchE活性的降低[7-8]，但也有研究表明乙酰膽堿酯酶活性抑制可改善實驗性大鼠腦卒中的恢復[9]，董文哲等的研究也表明膽堿酯酶抑制劑新斯的明對缺血性腦損傷大鼠具有保護作用[10]。因此在該問題上還存在爭議，尚需進一步研究確實。

目前有關(guān)腦缺血損傷的生化及分子機制主要涉及炎癥介質(zhì)釋放與過氧化損傷，一氧化氮(NO)在腦缺血時的神經(jīng)毒性作用、細胞凋亡、興奮性氨基酸毒性、中樞膽堿能系統(tǒng)障礙等方面[11-12]，本研究只選擇了兩個劑量在預防給藥的前提下就其中的兩方面機制做了初步的探討，但是缺血性腦卒中的病理生理過程是一個多環(huán)節(jié)、多因素、多途徑損傷的酶促級聯(lián)反應,病理機制非常復雜，至于本藥物在其他劑量及其他給藥方式下的作用及機制尚需進一步開展研究，這也是本課題下一步即將開展的工作。

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(責任編輯：陳思敏）

The protective effect of Anisodine Hydrobromide on acute cerebral ischemia-reperfusion injury in rats

/CHEN Dan-dan1,2 , PENG Cheng1, XIE Xiao-fang1 , LIU Han 1, PAN Yuan1//(1. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan;,2 Ya’an Polytechnic college, Ya’an 625000 ,Sichuan)

Objective: To investigate the protective effect of Anisodine Hydrobromide on acute cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Method: The model of rat acute cerebral ischemia-reperfusion injury was established through middle cerebral artery occlusion-reperfusion. Anisodine Hydrobromide was injected before model establishment. The behavior, cerebral infarction size and water content of ischemic rats were evaluated, and the infuence on NO,NOS, Ach and AchE in serum were measured. Result: The low dose of Anisodine Hydrobromide could significantly improve the behavior of ischemic rats and show a tendency of decreasing infarct size water content, NOS activity and NO content. Large dose showed the tendency in improving behavior, infarct size, NOS activity and Ach content. Conclusion: Anisodine Hydrobromide has protective effect against brain damage induced by occlusion –reperfusion in middle cerebral artery of rats.

Anisodine Hydrobromide; acute cerebral ischemia-reperfusion injury; NOS; Ach

R 285.5

A

1674-926X(2016)06-009-03

1成都中醫(yī)藥大學藥學院 中藥材標準化教育部重點實驗室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 610075 2 雅安職業(yè)技術(shù)學院 ，四川 雅安 625000

陳丹丹（1986-）,成都中醫(yī)藥大學在讀博士研究生，就職于雅安職業(yè)技術(shù)學院，主要從事疾病動物模型與中藥復方藥理學研究

Email:chengdan88@126.com

彭成（1964-），研究員，主要從事疾病動物模型與中藥復方藥理研究

2016-04-01