曹便利，王蕎薇，連琦，謝媛媛*，王義明，羅國安

·炮制制劑·

銀杏葉中總黃酮醇苷成分定量分析方法研究

曹便利1,2，王蕎薇2，連琦2，謝媛媛2*，王義明2，羅國安2

目的：建立銀杏葉藥材中總黃酮醇苷類成分含量測定方法。方法：分別采用高效液相色譜法（HPLC法）和紫外-可見分光光度法（UV法）測定銀杏葉中黃酮類成分的含量，所測得結(jié)果進行比較。HPLC法為改良藥典方法，采用Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，柱溫35 ℃，流動相為0.4 %磷酸-甲醇（50:50），流速1.0 mL·min-1，檢測波長為360nm。結(jié)果：HPLC法測定山柰酚、槲皮素和異鼠李素分別在1.20–120 mg·L-1，1.50–150 mg·L-1，0.68–68 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好（r= 1.000）；UV法蘆丁在8.84–26.52 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好（r = 0.9993），加樣回收率為102.4%。采用HPLC法測定銀杏葉中總黃酮含量（上述3種成分含量之和 × 2.51）顯著低于UV法測定結(jié)果，說明銀杏葉藥材中含有其他酚酸類成分。結(jié)論：該方法簡便、準確、重現(xiàn)性好。

銀杏葉；總黃酮；山柰酚；鼠李素；槲皮素；高效液相色譜法；含量測定

近現(xiàn)代以來，各國學(xué)者已從銀杏葉中發(fā)現(xiàn)多種神經(jīng)保護、抗腫瘤、抗病毒、抗菌抗炎活性成分，包括黃酮類、萜類、酚類、聚異戊烯醇類等[1]。銀杏葉提取物也已成為功能性保健食品中使用頻次最高的15個原料之一[2]。其中銀杏葉黃酮醇苷類成分是銀杏葉原料及其制劑質(zhì)量控制重要指標成分[3]。黃酮醇苷類成分水解后只有3種黃酮醇苷元，即槲皮素、山柰酚和少量異鼠李素，因此，2010年版《中國藥典》收載的銀杏葉及其制劑的質(zhì)量標準中，均采用鹽酸水解后HPLC測定上述3種苷元的含量[4-5]。紫外-分光光度法是常見總黃酮測定方法之一，其中以亞硝酸鈉–硝酸鋁–氫氧化鈉法最常用，但因具有鄰二酚羥基的非黃酮類物質(zhì)在最大波長處510 nm左右也有較強吸收，所以本法專屬性不強，而銀杏葉黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中含有5-羥基、4-羰基，能與AlCl3進行反應(yīng)生成有色的絡(luò)合物，是一個針對性較強的銀杏葉總黃酮含量測定方法。

本研究在2010年版《中國藥典》銀杏葉項下收載的總黃酮醇苷含量測定方法基礎(chǔ)上，對供試品溶液制備方法進行系統(tǒng)考察和優(yōu)化，提高了檢測效率，并測定了不同采收期銀杏葉藥材中總黃酮醇苷類成分含量測定，同時與紫外分光光度法測定的總黃酮醇苷含量比較，旨在為銀杏葉藥材質(zhì)量標準化研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200 series 高效液相色譜儀（包括在線脫氣機G1322A，低壓二元梯度泵G1312A，自動進樣器G1329A，柱溫箱G1316A，二極管陣列檢測器G1315D，ChemStation化學(xué)工作站，美國Agilent科技有限公司），RQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），PB303-N電子天平（MEETTLER TOLEDO，0.001 g），UV-1100紫外可見分光光度計（恒業(yè)儀器公司）；Milli-Q Synthesis 超純水純化系統(tǒng)（美國密理博公司）；XS105型電子天平（d=0.01mg，梅特勒-托利多公司），KQ-500E型超聲波清洗器（功率500W，頻率40kHz），0.45 μm微孔濾頭（津騰公司）。

1.2 對照品

蘆丁（純度大于98%，批號100080-200707），槲皮素（純度大于98%，批號100081-200907），山柰酚（純度大于98%，批號110861-200808）和異鼠李素（純度大于98%，批號110860-200608）均購于中國藥品生物制品檢定所。

1.3 試劑

甲醇、乙醇、鹽酸、磷酸（分析純，北京化工廠），甲酸（色譜純，F(xiàn)isher），乙腈、甲醇（色譜純，F(xiàn)isher）；結(jié)晶三氯化鋁（北京化工廠，分析純）。

1.4 藥材

本實驗所有34批銀杏葉藥材（表1）分別于不同季節(jié)采集于山東郯城、陜西寧強和江蘇邳州等地，經(jīng)黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司許照芹高級工程師鑒定均為銀杏（Ginkgo biloba L.）的干燥葉，憑證標本存放于清華大學(xué)化學(xué)系。

2 方法

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱：PhenomenexLuna C18色譜柱（4.6 × 250 mm，5 μm）；以乙腈-0.4%磷酸（50:50）為流動相；檢測波長：360 nm；柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：20 μL；理論塔板數(shù)以槲皮素、山柰酚和異鼠李素計算均為10000以上。3種組分之間分離度大于1.5，拖尾因子在0.8～0.9之間。

2.2 供試品溶液制備

取銀杏葉粉末1.00 g，精密稱定，加5%鹽酸-甲醇溶液30 mL，加熱回流（90 ℃）水解提取30 min，放冷，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，并加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液（HPLC）。

精密稱取銀杏葉0.5 g，置于150 mL圓底燒瓶中，加入70 %甲醇20 mL，加熱回流（90 ℃）提取兩次，每次30 min，合并兩次70 %甲醇提取液，水浴蒸干，用甲醇定容至10mL。精密量取1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇5 mL，加0.1 mol/L的三氯化鋁溶液1 mL，搖勻，置70 ℃水浴加熱10 min，放置15 min顯色，加甲醇定容至刻度，即得（UV）。

2.3 標準曲線制備

精密稱取槲皮素、山柰酚、異鼠李素對照品各2.89 mg、3.80 mg、1.70 mg，于25 mL棕色量瓶中，加5 %鹽酸-甲醇溶液溶解、定容，搖勻。精密吸取該溶液0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL，分別置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得各濃度對照品混合溶液（HPLC）。精密吸取各濃度對照品混合溶液20 μL，按2.1項下色譜條件進樣分析，重復(fù)進樣3次，以峰面積（Y）對濃度（X）作標準曲線，各指標成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測限（LOD）及定量限（LOQ）見表1。

表1 回歸方程、線性范圍及檢測限、定量限

精密稱取蘆丁對照品4.52 mg于10 mL量瓶中，加甲醇溶解、定容、搖勻。精密吸取該溶液0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇5 mL，加0.1 mol·L-1的三氯化鋁溶液1 mL，搖勻，置70 ℃水浴加熱10 min，放置15 min顯色，加甲醇定容至刻度，即為各濃度對照品溶液（UV法）。取各濃度對照品溶液，分別在410 nm處測定吸光度，以對照品質(zhì)量濃度（X，mg·mL-1）為橫坐標，吸光度（Y）為縱坐標，繪制標準曲線并進行回歸計算，結(jié)果表明蘆丁在0.00884～0.02652 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=28.82X-0.028（r =0.999 3）。

2.4 定量法

精密吸取各供試溶液（HPLC）20 μL，按2.1項色譜條件進樣分析，每個樣品測定3次。由各供試溶液所測得峰面積，根據(jù)回歸方程式，計算供試品中槲皮素、山柰酚和異鼠李素含量，按下式換算成總黃酮醇苷的含量。

總黃酮醇苷含量=(槲皮素含量+山柰酚含量+異鼠李素含量)×2.51

取各供試溶液（UV），以甲醇為空白，在410 nm波長處測定吸光度，每個樣品測定3次，根據(jù)蘆丁回歸方程式，計算供試品中總黃酮醇苷的含量。

3 結(jié)果

3.1 分析條件的選擇

銀杏葉供試溶液（UV）最大吸收波長為（410±1）nm，UV測定波長選擇為410 nm；由槲皮素、山柰酚和異鼠李素對照品溶液紫外掃描圖譜，可見各自最大吸收波長均為360 nm，故選擇360 nm作為HPLC測定波長。在流動相乙腈-0.4%磷酸（50:50），流速：1.0 mL·min-1洗脫條件下，槲皮素、山柰酚和異鼠李素均達到基線分離，峰形對稱，保留時間（tR）分別為16.5，28.5和32 min (圖1)。

圖1 銀杏葉藥材水解液中黃酮苷元類成分HPLC圖A-對照品；B-銀杏葉藥材（批號：YL14110804）；1-槲皮素；2-山柰酚；3-異鼠李素

3.2 精密度試驗

精密吸取銀杏葉（批號YL14110804）供試溶液（HPLC）20μL，按2.1項下色譜條件進樣分析，重復(fù)測定6次，3指標成分峰面積值RSD為0.23%-3.35%。表明方法采用的HPLC儀器及整體系統(tǒng)精密度良好。

取銀杏葉（批號YL14110804）供試溶液（UV），在410 nm波長處測定吸收度，重復(fù)測定6次，吸收度值RSD為0.32%，表明儀器精密度良好。

3.3 重復(fù)性試驗

取銀杏葉（批號YL14110804）按2.2項下制備6份供試溶液（HPLC），按2.1項下色譜條件進樣分析，每份樣品重復(fù)測定3次，并計算槲皮素、山柰酚和異鼠李素的含量，RSD分別為1.53%-1.64%，重復(fù)性良好。

取銀杏葉（批號YL14110804）按2.2項下制備6份供試溶液（UV），在410 nm波長處測定吸收度，每份樣品重復(fù)測定3次，并計算總黃酮醇苷的含量，RSD為0.271%，重復(fù)性良好。

3.4 穩(wěn)定性試驗

取銀杏葉（批號YL14110804）供試溶液（HPLC），分別于量瓶中保存，于0，2，4，8，12，24 h按2.1項色譜條件進行分析，重復(fù)測定3次，其峰面積值RSD為0.48%-3.05%，結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

取銀杏葉（批號YL14110804）供試溶液（UV）在室溫下放置，分別測定顯色后0、10、20、30、40、50、60 min在410 nm處吸光度值，吸光度的RSD為0.302%，結(jié)果表明UV法供試品溶液在顯色后60min內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.5 加樣回收試驗

精密稱取已知含量的銀杏葉藥材粉末（批號YL14110804）0.5 g，共9份，按80%，100%，120%3個目標濃度，分別精密加入槲皮素、山柰酚和異鼠李素的對照品適量，每一質(zhì)量濃度取3份，按2.2項下方法制備HPLC加樣回收率供試液，按2.1項下色譜條件測定，計算平均加樣回收率，HPLC加樣回收率在99.1%～103.4%。

精密稱取已知含量的銀杏葉藥材粉末（批號YL14110804）0.25 g，共6份，分別精密加入蘆丁對照品3.28 mg，按照2.2項下制備UV法加樣回收率供試液，依法測定，計算蘆丁的回收率為102.1%，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗（n=3）

3.6 樣品含量測定

分別以HPLC和UV法測定了34批銀杏葉中總黃酮醇苷類成分含量，結(jié)果見表3。

表3 銀杏葉總黃酮苷類成分含量測定結(jié)果

a總黃酮醇苷含量=(槲皮素含量+山柰酚含量+異鼠李素含量)×2.51

4 討論

4.1 供試品溶液制備方法考察

2010年版《中國藥典》[6]銀杏葉項下總黃酮醇苷的含量測定方法中，樣品供試品溶液制備方法如下：取本品中粉約1 g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷回流提取2 h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干，加甲醇回流提取4 h，提取液蒸干，殘渣加甲醇-25%鹽酸溶液(4:1)混合溶液25 mL，加熱回流30 min，放冷，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，并加甲醇至刻度，搖勻，即得。整個制備過程需要索氏提取器提取、加熱回流提取、減壓濃縮和水解等4個步驟，耗時約8小時，存在著操作繁瑣，分析效率低等問題；為此本研究首先對2010年版《中國藥典》分析方法的提取效率進行考察：比較了①三氯甲烷索氏提取除雜+甲醇加熱回流提取+甲醇-25%鹽酸溶液水解（藥典方法）；②甲醇加熱回流提取+甲醇-25%鹽酸溶液水解；③甲醇-25%鹽酸溶液水解3種樣品前處理方法對水解液中3種黃酮苷元含量的影響。結(jié)果如圖2所示：現(xiàn)行藥典中所采用的提取方法中三氯甲烷索氏提取除雜步驟會導(dǎo)致部分以槲皮素為苷元的黃酮醇苷類成分損失，而使得測定結(jié)果中水解液中槲皮素含量偏低；而甲醇加熱回流提取后再水解與直接用甲醇-25%鹽酸溶液加熱回流水解提取相比，3種黃酮苷元類成分含量沒有顯著性差異。綜合考慮提取效率、環(huán)境負荷等多方面因素，本研究選擇直接用鹽酸甲醇溶液水解提取，并對提取方式、提取溶劑、提取溶劑中鹽酸濃度、提取溶劑用量、水解提取溫度及時間等進行了系統(tǒng)考察。研究結(jié)果表明，提取溫度和提取溶劑中鹽酸濃度對3種黃酮苷元含量測定結(jié)果影響最為顯著。圖3所示為不同水解溫度對3種黃酮苷元提取效率的影響，隨著溫度升高，3種黃酮苷元類成分提取效率逐漸升高，提取溫度為90 ℃時提取效率最大，到100 ℃時略有下降，故控制水解提取溫度為90 ℃。圖4所示為提取溶劑中不同鹽酸濃度對3種黃酮苷元提取效率的影響，采用5%鹽酸甲醇溶液進行水解提取效率最高。采用本法測定批號YL14110804銀杏葉HPLC供試溶液中槲皮素、山柰酚和異鼠李素的含量分別為0.67 mg/g、1.00 mg/g和0.29 mg/g，略高于藥典法測定結(jié)果（槲皮素、山柰酚和異鼠李素的含量分別為0.62 mg/g、0.91 mg/g和0.26 mg/g），本法操作更為簡便，省時，同時減少操作步驟也避免了中間環(huán)節(jié)的系統(tǒng)誤差，提高檢測結(jié)果的準確性。

圖2 不同提取方法對三種黃酮苷元類成分提取效率的比較方法A：三氯甲烷索氏提取除雜+甲醇加熱回流提取+甲醇-25%鹽酸溶液水解（藥典方法）；方法B：甲醇加熱回流提取+甲醇-25%鹽酸溶液水解；方法C：甲醇-25%鹽酸溶液水解

圖3 不同水解溫度對三種黃酮苷元提取效率的影響

圖4 提取溶劑中不同鹽酸濃度對三種黃酮苷元提取效率的影響

4.2 銀杏葉中總黃酮類成分含量比較

本實驗建立了銀杏葉藥材中總黃酮醇苷類成分的含量測定方法，比較了HPLC與UV法測定結(jié)果。紫外分光光度法測定的總黃酮類成分含量顯著高于HPLC法測定結(jié)果，提示在銀杏葉中除黃酮醇苷類成分外，還存在有其他酚酸類成分，有待進一步研究探明它們的結(jié)構(gòu)信息。本研究所收集得到的34批銀杏葉藥材中總黃酮醇苷類成分含量在0.45～0.90%之間，均符合2010年版《中國藥典》對銀杏葉藥材中總黃酮醇苷類成分含量不得少于0.4%的規(guī)定。不同批次銀杏葉中黃酮醇苷類成分含量差異較大，推測與不同采收季節(jié)和采收時間有關(guān)。

本實驗同時開展了銀杏葉中銀杏酚酸類成分、銀杏內(nèi)酯類成分的含量與采收季節(jié)、產(chǎn)地等的相關(guān)性研究，以期為銀杏葉藥材品質(zhì)綜合評價和合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)[7]。

[1] Teris A. van Beek, Paola Montoro. Chemical analysis and quality control of Ginkgo biloba leaves, extracts, and phytopharmaceuticals. Journal of Chromatography A, 2009, 1216: 2002–2032.

[2] 薩翼, 淺淡含中藥提取物的保健食品工藝及質(zhì)量控制[J], 中國中醫(yī)藥信息雜志, 2013, 20 (6): 3-16.

[3] Teris A. van Beek, Chemical analysis of Ginkgo biloba leaves and extracts. Journal of Chromatography A, 2009, 967: 21–55.

[4] 謝培山, 銀杏葉標準提取物EGb761及銀杏葉制劑的質(zhì)量評價(待續(xù))[J], 中國中藥雜志, 1999, 24 (1): 3-5.

[5] 謝培山, 銀杏葉標準提取物EGb761及銀杏葉制劑的質(zhì)量評價(續(xù)完)[J], 中國中藥雜志, 1999, 24 (1): 116-118.

[6] 國家藥典委員會.中國藥典[S]. 一部. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010.

[7] 王蕎微, 謝媛媛, 王義明, 梁瓊麟, 羅國安, 銀杏葉中銀杏酚酸類成分含量測定方法研究[J], 中國藥學(xué)雜志, 2015, 50(2): 167-173.

(責(zé)任編輯：傅舒)

Study on quantitative determination of total flavonoids in ginkgo folium

/CAO Bian-li1,2, WANG Qiao-wei2, LIAN Qi1,2, XIE Yuan-yuan2,WANG Yi-ming2, LUO Guo-an2// (1. Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, Jiangxi; 2.Department of Chemistry, Tsinghua University, Beijing 100084, China.)

Objective:To establish the quantitative determination of favonoids in ginkgo folium. Method:The favonoids content in ginkgo folium was detected by HPLC and UV-Vis method, and results from both methods were compared. The HPLC was performed on Phenomenex C18column (250mm × 4.6mm, 5μm) with the mobile phase consisting of 0.4% phosphoric acid aqueous solution and methanol (50: 50). The fow rate was 1.0 mL·min-1, and the detective wavelength was 360 nm. Result:The linear ranges of kaempferol, quercetin and rhamnetin in HPLC determination were 1.20～ 120 mg·L-1, 1.50～150 mg·L-1and 0.68～68 mg·L-1with r of 1.000. The linear range of rutin in the UV determination was 8.84 ～ 26.52 mg·L-1with r of 0.999 3, and its recovery was 102.3%. The contents of total favonoids in ginkgo folium samples detected by HPLC method were signifcantly less than those by the UV method, which suggested that it might contain other phenolic acids. Conclusion:This method is simple, accurate, and practical for the quality control of ginkgo folium.

Ginkgo folium; total favonoids; kaempferol; quercetin; rhamnetin; HPLC; quantitative analysis.

R 284.1

A

1674-926X(2016)06-005-05

重大新藥創(chuàng)制（2014ZX09304307001-010）中藥新藥安全性檢測技術(shù)與標準研究；

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西南昌330004；2.清華大學(xué)化學(xué)系，北京 100084

曹便利（1988-），女，碩士在讀，從事中藥質(zhì)量標準研究

Tel:18710229816 Email:1063212759@qq.com

謝媛媛（1980-），女，博士，高級工程師，研究方向：中藥質(zhì)量控制

Tel:010-62772265 Email:yuanyuan8078@gmail.com

2015-04-12