李蒙蒙 郭巧生 史紅專 王嘉 戴道新 閆士猛 齊恒基 蘆鑫 劉立濤

[摘要]采用生物量測定、3，5二硝基水楊酸比色法、對棕櫚酸硝基苯酯（ρNPP）比色法、福林酚法等方法研究不同養(yǎng)殖密度和換水頻率對螞蟥生長、消化酶活性、生化指標和內在品質的影響。結果表明：螞蟥的最終質量，特定生長率（SGR），增重率（WGR），淀粉酶，脂肪酶，蛋白酶活力，SOD，CAT，ALP酶活性與密度呈反比，與換水頻率呈正比（P<005）；換水頻率與水中氨氮、亞硝酸鹽和硫化氫呈負相關，與溶氧量呈正相關；養(yǎng)殖密度和換水頻率對螞蟥水分、總灰分、酸不溶性灰分、pH和抗凝血酶活性影響不顯著。因此，每畝50萬條為較適宜的養(yǎng)殖密度，每72 h 1次為較適宜的換水頻率。

[關鍵詞]螞蟥；養(yǎng)殖密度；換水頻率；生長；消化酶；抗逆酶

螞蟥Whitmania pigra Whitman，又名寬體金線蛭，屬于環(huán)節(jié)動物門黃蛭科動物[1]，其干燥全體為中藥材水蛭，是《中國藥典》2015年版水蛭藥材收載主要來源，具有破血通經，逐瘀消癥的功效[2]。由于市場對水蛭藥材的巨大需求以及環(huán)境污染的日益加重，導致野生螞蟥資源瀕臨枯竭。目前雖然螞蟥室外人工養(yǎng)殖技術取得了初步成功，但仍存在許多諸如水溫、光照等不可控因素，嚴重影響了產量和經濟效益。近幾年來有關螞蟥適宜生長的溫度、呼吸和消化等生理特性以及分子生物學都進行了相關研究 [38]，但鮮見養(yǎng)殖密度和換水頻率對螞蟥生長影響的相關研究報道，本實驗擬研究不同養(yǎng)殖密度和換水頻率對螞蟥生長和內在品質的影響，以期為螞蟥室內養(yǎng)殖提供參考和依據。

1材料

螞蟥由南京農業(yè)大學中藥材研究所提供，經郭巧生教授鑒定為螞蟥W pigra；螺螄（采自南京前湖，野生）經郭巧生教授鑒定為梨形環(huán)棱螺Bellamya purificata Heude；曝氣24 h的自來水。

電子天平（山海精密儀器廠）、5810R離心機（eppendorf）、756CRT紫外分光光度計（上海精密儀器有限公司）、FA1104分析天平（上海精科天平廠）、勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司）、pH計（青島昱昌科技有限公司）、FW100小型高速粉碎機（天津華鑫儀器廠）、KQ250B超聲儀（昆山市超聲儀器公司）、電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）、HHS型水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責任公司）、MR210A溶氧測量儀（南京特安科貿有限公司）、YC07型水質分析儀（青島昱昌科技有限公司）。

DNS試劑、ρNPP溶液、福林酚試劑、考馬斯亮藍G250、連苯三酚、324 mmol·L-1鉬酸銨溶液、50 mmol·L-1對硝基苯磷酸二鈉。

2方法

21實驗設計實驗在室內進行，容器為容積2 L的塑料瓶（瓶底面積133×10-2 m2，實際養(yǎng)殖用水1 L，水深12 cm），實驗螞蟥體重為（095±016） g。設5個養(yǎng)殖密度，分別為1（按照瓶底面積算，相當于5萬條/畝），5，10，15，20條/瓶，分別標記為SD1，SD2，SD3，SD4，SD5組，每個處理重復10次，24 h換水1次。設置5個換水頻率，分別為每隔12，24，48，72，96 h 換水1次，每次換水1 L，每瓶10條螞蟥，每個處理重復10次，分別標記為H1，H2，H3，H4，H5組。實驗期間其他管理方法相同，投喂經自來水暫養(yǎng)3 d后的新鮮螺螄，實驗時間40 d，期間保持室溫（25±1） ℃。

22樣品的采集和保存實驗結束時，每個平行組隨機取10條螞蟥，將活螞蟥于冰盤內解剖，取消化道，用預冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干表面水分，稱重，冰浴中勻漿，用生理鹽水稀釋成含原漿20%的溶液，冷凍離心10 min（轉速為1萬r·min-1），取上清液為酶液，置于4 ℃冰箱中保存，并在24 h內測定完成。

每個平行組隨機選取15條螞蟥，在50 ℃條件下干燥24 h，粉碎后過40目篩，置于試劑瓶中干燥避光保存，用于測定內在品質。

23生長性能的測定分別在實驗開始和結束時稱量各瓶中螞蟥的體重，計算出平均質量，由公式計算特定生長率（SGR）和增重率（WGR）。SGR=（lnWt-lnW0）/t×100%；WGR= （Wt-W0）/W0×100%，式中W0為實驗開始時螞蟥的平均質量（g），Wt為結束時螞蟥的平均質量（g），t為實驗天數(shù)（d）。

24消化酶活性的測定方法蛋白酶活性測定采用福林酚法[9]在37 ℃，pH分別為32，92時，每分鐘水解干酪素產生1 μg酪氨酸定義為1個蛋白酶活力單位（U）；淀粉酶的活力測定采用3，5二硝基水楊酸比色法[9]在37 ℃時，單位體積酶量，每分鐘水解淀粉生成1 mg還原糖的產量為1個酶活力單位（U）；脂肪酶活力測定采用對棕櫚酸硝基苯酯（ρNPP）比色法[10]在37 ℃，pH 82時，每分鐘催化釋放1 μmol對硝基酚所需的酶量定義為一個酶活力單位（U）。

25超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和堿性磷酸酶的活性測定方法SOD活性測定采用鄭碧玉等[11]的方法，25 ℃下，1 mL反應液中每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達50%時的酶量定為1個活力單位（U）。CAT活性采用比色法測定[12]，每分鐘分解1 μmol的過氧化氫即為1個酶活力單位（U）。ALP活性測定參考芶琳等[13]的方法，30 ℃條件下，每分鐘產生1 μmol的對硝基酚，為1個酶活力單位（U）。

組織勻漿液的蛋白含量以考馬斯亮藍比色法測定。

酶的比活力=酶活力/蛋白含量

26螞蟥內在品質的測定方法參考《中國藥典》[2]2015年版一部測定水蛭藥材的水分、總灰分、酸不溶性灰分、pH、抗凝血酶活性。

27水體質量的測定每個處理組換水時測定水體質量。使用溶氧儀測定水中溶氧量；使用水質分析儀測定水中氨氮、亞硝酸鹽和硫化氫的含量。

28數(shù)據分析采用Microsoft Excel 2013和SPSS 190（Oneway ANOVA，多重比較采用Duncan′s法）進行數(shù)據分析。

3結果與分析

31不同養(yǎng)殖密度和換水頻率對螞蟥生長性能的影響SD1特定生長率和增重率顯著大于其他4組（P<005），SD2的特定生長率與SD3沒有差異，與SD4和SD5相比有顯著性差異（P<005）。換水頻率與最終體重、特定生長率和增重率成反比，其中H5顯著小于H1和H2（P<005），其他各組之間沒有顯著性差異，見表1。

32不同養(yǎng)殖密度和換水頻率對螞蟥消化酶活性的影響消化酶活性與密度基本成負相關。其中淀粉酶：SD1最高，與其他4組均有顯著性差異（P<005），SD3，SD4和SD5之間沒有顯著性差異，但均與SD2有顯著性差異（P<005）；脂肪酶：除SD1和SD2，SD4和SD5之間無顯著差異外，各組別之間均顯著差異（P<005）。酸性蛋白酶：SD1，SD2，SD3組顯著高于SD4和 SD5組（P<005），其他各組之間無顯著性差異。堿性蛋白酶：SD1顯著大于其他各組（P<005），其中SD2，SD3與SD4，SD5相比有顯著性差異（P<005），見表2。消化酶活性與換水頻率基本成正相關。其中淀粉酶：H1顯著高于其他4組（P<005），其中H4，H5淀粉酶活性顯著小于H2，H3（P<005）；H1的脂肪酶活性和堿性蛋白酶活性顯著高于其他各組（P<005）；H5酸性蛋白酶活性顯著小于H1，H2（P<005）。

33不同養(yǎng)殖密度對螞蟥抗逆酶活性的影響抗逆酶活性與密度基本成負相關。SD4，SD5的SOD活性，顯著小于其他各組（P<005）。SD2，SD3的CAT活性顯著小于SD1（P<005），顯著大于SD4，SD5（P<005）。SD1，SD2的ALP活性顯著高于其他各組（P<005），見表3。抗逆酶活性與換水頻率基本成正相關。H4，H5組SOD活性顯著小于其他各組（P<005）；H1，H2組CAT顯著高于其他各組（P<005）；H1組ALP活性顯著高于其他各組（P<005）。

34不同養(yǎng)殖密度和換水頻率對水蛭內在品質的影響?zhàn)B殖密度和換水頻率對水分、總灰分、酸不溶性灰分、pH和抗凝血酶活性影響不顯著，見表4。

35不同換水頻率對水體質量的影響換水頻率與水中氨氮、亞硝酸鹽和硫化氫呈負相關，與溶氧量呈正相關，各組之間呈顯著性差異（P<005），見表5。

4討論

41不同養(yǎng)殖密度對螞蟥生長和消化酶活性的影響?zhàn)B殖密度是影響水生生物生長的一個重要因素[1415]，研究發(fā)現(xiàn)隨著養(yǎng)殖密度增大，群體內的競爭加劇，對個體攝食產生負面影響[16]。本研究結果顯示，螞蟥特定生長率與養(yǎng)殖密度成反比、與換水頻率成正比，與孫學亮等[17]關于半滑舌鰨、張?zhí)鞎r等[18]對中國對蝦和肖鳴鶴等[19]關于克氏原螯蝦的研究結果相似。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，隨著養(yǎng)殖密度的增加，螞蟥種群間的個體差異度增大，Brett[20]認為這是由于種群內個體爭奪有限的食物資源，使小個體不能夠獲得充足的食物，從而導致個體間的生長差異，此外高密度組螞蟥由于組內個體之間競爭增大可能導致能量消耗增加，進而生長率下降。

Fendersen[21]等研究發(fā)現(xiàn)，高密度養(yǎng)殖會引起生物行為和生理變化，從而對養(yǎng)殖生物生長產生有害的影響。消化酶活性是衡量消化能力的重要指標[22]，本實驗結果顯示密度與螞蟥消化酶活性成反比，與肖鶴鳴等[19]的報道相似，因此可能高密度組螞蟥組間個體競爭加劇導致消化酶活性降低從而使攝食量減少或消化不良，進而影響了生長。

42不同換水頻率對螞蟥生長、消化酶活性、水體質量的影響換水頻率的增加能有效的增加水體中的氧含量，水體中溶解氧含量豐富會使氧化分解作用活躍，加速水中污染物的降解[23]。李健等[24]報道水體中氨氮、硫化氫等有害物質的含量與溶解氧有密切關系，水中溶氧量減小使NH4+N和NO2-N等積累 [2527]。吳垠等[28]發(fā)現(xiàn)水中溶氧量下降時虹鱒幼魚生長下降，姚雪梅等[29]報道NO2-濃度大小與海參的生長呈負相關。本實驗顯示換水頻率與水中溶氧量呈顯著負相關，與氨氮、亞硝酸鹽和硫化氫呈正相關，與以上實驗結果相符合。雖然換水頻率和水體質量的研究報道較多，但目前為止鮮見換水頻率和消化酶的相關性研究，本實驗顯示換水頻率與螞蟥的SGR和消化酶呈正相關（P<005），推測換水頻率在對水質造成影響的同時，抑制了螞蟥消化酶活性，影響了螞蟥的進食和消化，進而影響其生長。

43不同養(yǎng)殖密度和換水頻率對螞蟥抗逆酶活性的影響免疫系統(tǒng)被認為是一種幫助魚類應對損傷的自適應和修復機制[30]，過高的養(yǎng)殖密度會成為一種脅迫，影響魚類的免疫系統(tǒng)和抗氧化能力[31]。活性氧通過影響細胞膜功能和酶活性使細胞加速老化和凋亡，活性氧增加時會誘導魚類抗氧化酶分泌，包括SOD，CAT[3132]，ALP在動物體內普遍存在，參與磷酸基團的代謝，也是溶酶體的組成部分，在免疫反應中具有重要作用[33]。本研究表明SOD，CAT和ALP隨著養(yǎng)殖密度的增大和換水頻率的減少呈現(xiàn)減小趨勢，這與曹陽等[34]關于俄羅斯鱘幼魚、彭士明等[35]關于銀鯧魚、吳宗凡等[36]關于鯽的報道相似，可能是螞蟥在慢性脅迫過程中，螞蟥免疫機制失調導致SOD，CAT，ALP活力降低，如王文博等[37]報道短期擁擠脅迫會使鯽魚血液溶菌酶水平升高，長期脅迫則出現(xiàn)下降，至于短期脅迫對螞蟥免疫機制的影響有待今后進一步研究。

44不同養(yǎng)殖密度和換水頻率對螞蟥內在品質的影響本研究的結果表明，養(yǎng)殖密度和換水頻率對螞蟥內在品質的影響都不顯著，其中水分、總灰分、酸不溶性灰分含量都低于2015年版《中國藥典》，說明雜質含量低?？鼓富钚跃哂?015年版藥典標準，表明所得水蛭品質優(yōu)良。綜上可知實驗所得螞蟥內在品質都能滿足2015年版《中國藥典》標準。

5小結

本實驗結果顯示密度為SD1時螞蟥生長性能最高，但最終產量（413 kg/畝）小于SD3組（1 384 kg/畝），換水頻率H4組對螞蟥生長的影響與其他4組沒有顯著性差異，如果大規(guī)模養(yǎng)殖，從經濟效益和成本控制來說，選擇SD3密度、H4換水頻率是最佳的組合。

[參考文獻]

[1]楊潼.中國動物志·環(huán)節(jié)動物門蛭綱[M].北京：科學出版社，1996：136.

[2]中國藥典.一部[S].2015：83.

[3]史紅專，郭巧生，陸樹松，等.不同月齡螞蟥內在品質及最佳采收期研究[J].中國中藥雜志，2009，34（23）：3060.

[4]史紅專，劉飛，郭巧生.溫度對螞蟥生長及攝食規(guī)律影響的初步研究[J].中國中藥雜志，2006，31（23）：1944.

[5]史紅專，劉飛，郭巧生.溫度和體重對螞蟥人工繁殖影響的研究[J].中國中藥雜志，2006，31（24）：2030.

[6]史紅專，郭巧生，朱再標，等.不同溫度和pH對螞蟥消化道酶活性影響的初步研究[J].中國中藥雜志，2012，37（17）：2538.

[7]Liu F，Shi H Z，Guo Q S，et al.Isolation and characterization of microsatellite loci for the analysis of genetic diversity in Whitmania pigra[J].Biochem Syst Ecol， 2013， 51：7

[8]Liu F， Guo Q S， Shi H Z， et al Genetic diversity and phylogenetic relationships among and within populations of Whitmania pigra and Hirudo nipponica based on ISSR and SRAP markers[J] Biochem Syst Ecol， 2013， 51（4）：215

[9]胡瓊英，汪瑾.生物化學與分子生物學實驗[M].2版.北京：化學工業(yè)出版社，2010：28.

[10]鄭小梅.脂肪酶產生菌的篩選及其脂肪酶基因的克隆[D].北京：中國農業(yè)科學院，2009.

[11]鄭碧玉.改良的連苯三酚自氧化測定超氧化物歧化酶活性的方法[J] 生物化學與生物物理進展，1991，18（2）：163.

[12]桂遠明.水產養(yǎng)殖學專業(yè)實驗實習教材水產動物機能學實驗[M].北京：中國農業(yè)出版社，2004：124.

[13]芶琳，單志.生物化學實驗[M] 成都：西南交通大學出版社，2010：103.

[14]Papoutsoglou S E， PapaparaskevaPapoutsoglou E， Alexis M N Effect of density on growth rate and production of rainbow trout （Salmo gairdneri Rich） over a full rearing period [J]. Aquaculture， 1987， 66：9

[15]Holm J C， Refstie T， BS The effect of fish density and feeding regimes on individual growth rate and mortality in rainbow trout （Oncorhynchus mykiss） [J] Aquaculture， 1990， 89：225

[16]Sawcer S J， Maranian M， Singlehurst S， et al Enhancing linkage analysis of complex disorders：an evaluation of highdensity genotyping [J] Hum Moecul Genet， 2004， 13（7）： 1943

[17]孫學亮，楊樹元，陳成勛，等.不同密度對半滑舌鰨生長和血液生化指標的影響[J].東北農業(yè)大學學報，2012，43（6）：100.

[18]張?zhí)鞎r，孔杰，劉萍，等.餌料和養(yǎng)殖密度對中國對蝦幼蝦生長及存活率的影響[J]. 海洋水產研究，2008，29（3）：41.

[19]肖鳴鶴，肖英平，吳志強，等.養(yǎng)殖密度對克氏原螯蝦幼蝦生長、消化酶活力和生理生化指標的影響[J].水產學報，2012（7）：1088.

[20]Brett J R Environmental factors and Growth [M]//Hoar W S， Randall D J， Brett J R Fish physiology Vol Ⅷ. Bioenergetics and growth New York： Academic Press， 1979：599

[21]Fendersen O C ， Carpenter M R Effect of crowding on the behavior of juvenile hatchery and wild land locked Atlantic salmon （Salmo solar L）[J] Animal Behavior， 1971， 19：439

[22]Martinez I， Moyano F J， FernandezDiaz， C， et al Digestive enzyme activity during larval development of the Senegal sole （Solea senegalensis） [J] Fish Physiol Biochem， 1999， 21： 317

[23]何本茂，韋蔓新 北海灣水體自凈能力的探討[J] 海洋環(huán)境科學，2004（1）：16

[24]李健，孫修濤，趙法箴.水溫和溶解氧含量對中國對蝦攝食影響的觀察[J] 水產學報，1993（4）：333

[25]賈治超，于剛，秦傳新，等.微生態(tài)制劑對仿刺參室內育苗中換水頻次的影響[J] 水產科學，2015，34（1）：20

[26]李玉全，李健，王清印，等.溶解氧含量和養(yǎng)殖密度對中國對蝦生長的影響[J].中國水產科學，2005，12（6）：751.

[27]沈南南，李純厚，賈曉平，等.小球藻與芽孢桿菌對對蝦養(yǎng)殖水質調控作用的研究[J].海洋水產研究，2008，29（2）：48.

[28]吳垠，張洪，趙慧慧，等.在循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中不同溶氧量對虹鱒幼魚代謝水平的影響[J].上海水產大學學報，2007（5）：437.

[29]姚雪梅，王紅勇，邢少雷，等.不同水溫和水質理化因子對糙海參攝食、生長影響研究[J].水產科學，2007（5）：292.

[30]Tim J B， Kim D T， Alison L M， et al Seasonal variation and the immune response： a fish perspective[J] Fish Shellfish Immunol， 2007， 22： 695

[31]Hegazi M M， Attia Z I， Ashour O A Oxidative stress and antioxidant enzymes in liver and white muscle of Nile tilapia juveniles in chronic ammonia exposure [J] Aquat Toxicoly， 2010， 99（2）： 118

[32]Basha P S， Rani A U Cadmiuminduced antioxidant defense mechanism in freshwater teleost Oreochromis mossambicus （Tilapia） [J] Ecotox Environ Safe， 2003， 56：218

[33]Zhang R Q， Chen Q X， Xiao R， et al.Inhibition kinetics of green crab （Scylla serrata） alkaline phosphatase by zinc ions： a new type of complexing inhibition[J] Biochim Biophys Acta Protein Struct Mol Enzymol， 2001， 1545：6

[34]曹陽，李二超，陳立僑，等.養(yǎng)殖密度對俄羅斯鱘幼魚的生長、生理和免疫指標的影響[J].水生生物學報，2014（5）：968

[35]彭士明，施兆鴻，孫鵬，等.養(yǎng)殖密度對銀鯧幼魚生長及組織生化指標的影響[J].生態(tài)學雜志，2010，29（7）：1371

[36]吳宗凡，時旭，程果鋒，等.養(yǎng)殖密度對溫室濕地循環(huán)水系統(tǒng)中鯽生長、生理及免疫指標的影響[J].南方水產科學，2014（5）：39

[37]王文博，汪建國，李愛華，等.擁擠脅迫后鯽魚血液皮質醇和溶菌酶水平的變化及對病原的敏感性[J] 中國水產科學，2004（5）：408

[責任編輯呂冬梅]