張?bào)@宇,張力娜,鄭永慧,孫永奇，劉路然,趙 虹，楊子超

150081黑龍江省哈爾濱市，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

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·論著·

Wnt信號(hào)通路抑制劑對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用及其作用機(jī)制研究

張?bào)@宇,張力娜,鄭永慧,孫永奇，劉路然,趙 虹，楊子超

150081黑龍江省哈爾濱市，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

【摘要】目的探究Wnt信號(hào)通路抑制劑(IWR-1)對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用及其作用機(jī)制。方法2014年1月—2015年8月，體外培養(yǎng)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，給予不同濃度IWR-1處理，采用MTT法測(cè)定腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖情況，并計(jì)算其抑制率，其中實(shí)驗(yàn)1組終濃度為5 μmol/L IWR-1、培養(yǎng)液、細(xì)胞懸液，實(shí)驗(yàn)2組終濃度為10 μmol/L IWR-1、培養(yǎng)液、細(xì)胞懸液，對(duì)照組添加等量培養(yǎng)液和細(xì)胞懸液。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Wnt5a蛋白、β-連鎖蛋白表達(dá)水平。結(jié)果實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制率高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)2組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制率高于實(shí)驗(yàn)1組(P<0.05)；培養(yǎng)48 h時(shí)實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制率均高于培養(yǎng)24 h(P<0.05)；培養(yǎng)48 h與24 h對(duì)照組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Wnt5a蛋白、β-連鎖蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)2組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Wnt5a蛋白、β-連鎖蛋白表達(dá)水平低于實(shí)驗(yàn)1組(P<0.05)。結(jié)論IWR-1能有效抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能與抑制Wnt5a蛋白和β-連鎖蛋白的表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】神經(jīng)膠質(zhì)瘤；腦腫瘤；細(xì)胞增殖；Wnt信號(hào)通路抑制劑

張?bào)@宇,張力娜,鄭永慧,等.Wnt信號(hào)通路抑制劑對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用及其作用機(jī)制研究[J].實(shí)用心腦肺血管病雜志，2016，24(3)：49-52.[www.syxnf.net]

Zhang JY，Zhang LN，Zheng YH，et al.Inhibiting effect of Wnt signaling pathway inhibitors on brain glioma cell proliferation and the action mechanism[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2016，24(3)：49-52.

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中最常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，位居所有癌癥死亡原因的前十位，患者平均生存時(shí)間為14.6個(gè)月，5年生存率<5%[1-2]。目前，臨床上治療腦膠質(zhì)瘤主要以手術(shù)為主，術(shù)后進(jìn)行輔助放化療，但患者術(shù)后平均生存期僅為3～5年，其總體治療效果仍不理想。因此，尋找治療腦膠質(zhì)瘤的新途徑或新靶點(diǎn)已成為臨床主要研究方向[3-4]。相關(guān)臨床研究表明，Wnt信號(hào)通路與中樞神經(jīng)系統(tǒng)關(guān)系密切，其可調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移和分化[5]。Wnt信號(hào)通路在胚胎發(fā)育完成后幾乎不再發(fā)揮相關(guān)功能，但在一定病理生理刺激下可被激活[6]，促使Wnt信號(hào)通路活化。有學(xué)者認(rèn)為，抑制Wnt信號(hào)通路或可成為腦膠質(zhì)瘤等基因治療的新方向[7]。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，并給予不同濃度的Wnt信號(hào)通路抑制劑(IWR-1)進(jìn)行處理，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖情況，探究IWR-1對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，并分析其作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1主要試劑與細(xì)胞高糖DMEM培養(yǎng)基(HyClone公司)，胎牛血清(杭州四季青集團(tuán)公司)，β-actin抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜，Millipore公司)；腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株購(gòu)自上海銳賽生物技術(shù)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)2014年1月—2015年8月，用移液槍吸取200 μl腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，混勻后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下觀察組織塊是否貼壁，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、細(xì)胞活性>95%的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MTT法取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，鋪板并將待測(cè)細(xì)胞密度調(diào)至3 000個(gè)細(xì)胞/孔，190 μl培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，分別添加5 μmol/L IWR-1、10 μmol/L IWR-1，記為實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h。培養(yǎng)完畢后，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入4 ℃預(yù)冷的10%三氯乙酸100 μl，靜置5 min后移入4 ℃冰箱中固定1 h，取出并用去離子水沖洗5遍，室溫晾干。每孔加入0.4%磺酰羅丹明B(SRB)染液100 μl，室溫下染色15 min后，棄去各孔內(nèi)染液，用1%乙酸沖洗5次，室溫晾干后，用非緩沖Tris-base堿液溶解，在平板振蕩器上振蕩20 min，酶標(biāo)儀測(cè)540 nm波長(zhǎng)處吸光度(OD)，并按公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率(%)=〔1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)〕×100%。每組重復(fù)檢測(cè)4次取平均值。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置空白組(僅添加等量的培養(yǎng)液)和對(duì)照組(添加等量培養(yǎng)液和細(xì)胞懸液)。

1.2.3蛋白質(zhì)印跡法加入RIPA裂解液150 μl及苯甲基磺酰氟(PMSF)1.5 μl冰上孵育30 min，4 ℃ 1 500 r/min離心15 min，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。每個(gè)樣本各取15 μg蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)PDVF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，再分別添加Wnt5a蛋白、β-連鎖蛋白一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗滌后加入1∶5 000二抗(北京中杉金橋生物科技公司)，用增敏化學(xué)發(fā)光底物試劑(ECL)處理后在凝膠成像系統(tǒng)顯像，采用Image J軟件進(jìn)行蛋白定量分析。每組重復(fù)檢測(cè)3次取平均值。

2結(jié)果

2.13組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制率比較3組培養(yǎng)24h、48h時(shí)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制率高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)2組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制率高于實(shí)驗(yàn)1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；培養(yǎng)48h時(shí)實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制率均高于培養(yǎng)24h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；培養(yǎng)48h與24h對(duì)照組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表1)。

Table1Comparisonofinhibitionratioofbraingliomacellsproliferationamongthethreegroups

組別培養(yǎng)24h培養(yǎng)48h對(duì)照組1.52±0.101.55±0.27實(shí)驗(yàn)1組41.57±1.38b60.49±1.35ab實(shí)驗(yàn)2組63.15±1.84bc86.73±2.67abcF值753.46544.36P值<0.001<0.001

注：與培養(yǎng)24 h時(shí)比較，aP<0.05；與對(duì)照組比較，bP<0.05；與實(shí)驗(yàn)1組比較，cP<0.05

2.23組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Wnt5a蛋白、β-連鎖蛋白表達(dá)水平比較3組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Wnt5a蛋白、β-連鎖蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Wnt5a蛋白、β-連鎖蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)2組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Wnt5a蛋白、β-連鎖蛋白表達(dá)水平低于實(shí)驗(yàn)1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2)。

表23組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Wnt5a蛋白、β-連鎖蛋白表達(dá)水平比較

Table2ComparisonofexpressionsofWnt5aproteinandβ-cateninofbraingliomacellsamongthethreegroups

組別Wnt5a蛋白β-連鎖蛋白對(duì)照組36.84±10.6251.02±12.46實(shí)驗(yàn)1組21.06±9.25a34.57±12.01a實(shí)驗(yàn)2組13.28±9.04ab20.14±10.58abF值234.57413.58P值<0.001<0.001

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與實(shí)驗(yàn)1組比較，bP<0.05

3討論

腦膠質(zhì)瘤為最常見(jiàn)的顱內(nèi)腫瘤，具有典型的“三高一低”(高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高病死率、低治愈率)特征[8]。腦膠質(zhì)瘤占腦腫瘤的50%左右，其發(fā)生發(fā)展與遺傳因素和環(huán)境因素共同作用有關(guān)，由于其呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)且邊界不明顯，因此手術(shù)并不能完全根除病灶，臨床治愈率極低[9-10]。目前臨床主要采用手術(shù)并輔以術(shù)后放化療治療腦膠質(zhì)瘤，但治療效果并不理想[11]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，生物靶向治療逐漸成為腦膠質(zhì)瘤的主要治療方向，尋找腫瘤診斷和預(yù)后的特異性分子標(biāo)志物以及藥物治療的靶目標(biāo)已成為時(shí)下研究的熱點(diǎn)[12]。

在腦膠質(zhì)瘤眾多相關(guān)潛在分子標(biāo)志物中β-連鎖蛋白備受矚目，β-連鎖蛋白不僅參與細(xì)胞的增殖及分化、組織器官生長(zhǎng)發(fā)育、損傷后組織修復(fù)等病理生理過(guò)程，且在諸多腫瘤組織中均呈高表達(dá)[13]。國(guó)內(nèi)外最新研究結(jié)果顯示，β-連鎖蛋白的表達(dá)水平與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后緊密相關(guān)，很可能是在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等多個(gè)環(huán)節(jié)中發(fā)揮作用的重要癌基因[14-15]。對(duì)Wnt信號(hào)通路的最早認(rèn)識(shí)來(lái)自于果蠅發(fā)育機(jī)制和致癌病毒的研究。Wnt/β-連鎖蛋白是經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路，也是目前研究較詳細(xì)的一條Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；其中，β-連鎖蛋白是Wnt信號(hào)通路中將信號(hào)向細(xì)胞核傳遞過(guò)程中的重要信號(hào)分子。β-連鎖蛋白作為Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，其去磷酸化可降低Wnt信號(hào)通路向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，是目前引起人們廣泛關(guān)注的靶向治療方案[16]。有學(xué)者認(rèn)為，抑制Wnt信號(hào)通路是腦膠質(zhì)瘤基因治療的新策略之一[17]。Wnt5a蛋白屬于Wnt蛋白家族成員之一，Wnt家族蛋白不僅在細(xì)胞的增殖、分化中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，亦在多種腫瘤中表達(dá)異常，或增高或降低或缺失。Wnt5a蛋白同樣也參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，包括腫瘤細(xì)胞血管生成、遷移、侵襲等惡性生物學(xué)過(guò)程[18]。

IWR-1是新合成的Wnt信號(hào)通路小分子抑制劑,可以通過(guò)穩(wěn)定Axin降解復(fù)合物而抑制Wnt信號(hào)通路[19]。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制率高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)2組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制率高于實(shí)驗(yàn)1組；培養(yǎng)48 h時(shí)實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制率均高于培養(yǎng)24 h；培養(yǎng)48 h與24 h對(duì)照組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制率間無(wú)差異；表明不同濃度的IWR-1對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖均具有明顯抑制作用，且濃度越高抑制作用越明顯。蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Wnt5a蛋白、β-連鎖蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)2組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Wnt5a蛋白、β-連鎖蛋白表達(dá)水平低于實(shí)驗(yàn)1組；表明IWR-1可抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Wnt5a蛋白、β-連鎖蛋白表達(dá)，而Wnt5a蛋白、β-連鎖蛋白即Wnt5a/β-連鎖蛋白信號(hào)途徑，因此推測(cè)Wnt5a/β-連鎖蛋白信號(hào)通路或可成為治療腦膠質(zhì)瘤的新靶點(diǎn)。

綜上所述，IWR-1能有效抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能與抑制Wnt5a蛋白和β-連鎖蛋白的表達(dá)有關(guān)。

作者貢獻(xiàn)：張?bào)@宇、趙虹進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；張力娜、鄭永慧、孫永奇、劉路然進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集；楊子超進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。

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(本文編輯：毛亞敏)

Inhibiting Effect of Wnt Signaling Pathway Inhibitors on Brain Glioma Cell Proliferation and the Action Mechanism

ZHANGJing-yu，ZHANGLi-na，ZHENGYong-hui，etal.DepartmentofNeurology，theFourthAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity，Harbin150081，China

【Abstract】ObjectiveTo explore the inhibiting effect of Wnt signaling pathway inhibitors(IWR-1)on brain glioma cell proliferation and the action mechanism.MethodsFrom January 2014 to August 2015，their brain glioma tissues were collected to culture in vitro.MTT method was used to detect the cell proliferation，and the inhibition ratio was calculated；thereinto the final concentration of A group was 5 μmol/L(including IWR-1，culture solution and cell suspension)，of B group was 10 μmol/L(including IWR-1，culture solution and cell suspension)，while C group included equivalent culture solution and cell suspension only.Western blot method was used to detect the expressions of Wnt5a protein and β-catenin.ResultsThe inhibition ratio of A group，of B group was statistically significantly higher than that of C group，respectively，and the inhibition ratio of B group was statistically significantly higher than that of A group(P<0.05).After 48 hours of culture，the inhibition ratio of A group，of B group was statistically significantly higher than that after 24 hours of culture，respectively(P<0.05)，while no statistically significant differences of inhibition ratio of C group was found compared to that after 24 hours(P>0.05).The expressions of Wnt5a protein and β-catenin of A group and B group were statistically significantly lower than those of C group，expressions of Wnt5a protein and β-catenin of B group were statistically significantly lower than those of A group(P<0.05).ConclusionIWR-1 can effectively inhibit the brain glioma cell proliferation，its action mechanism is possibly correlated with the inhibition of expressions of Wnt5a protein and β-catenin.

【Key words】Glioma；Brain neoplasms；Cell proliferation；Wnt signaling pathway inhibitors

(收稿日期：2015-12-03；修回日期：2016-03-06)

【中圖分類號(hào)】R 739.41

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi:10.3969/j.issn.1008-5971.2016.03.013

通信作者：趙虹，150081黑龍江省哈爾濱市，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；E-mail：zhaohong661214@163.com

基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12531257)