張文波，陳小菊，向小均，冷長燕(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川南充　637000)

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酪氨酸激酶受體RON在慢性阻塞性肺疾病患者肺組織中的表達(dá)及意義

張文波，陳小菊，向小均，冷長燕
(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川南充637000)

【摘要】目的:觀察酪氨酸激酶受體RON在慢性阻塞性肺疾病( chronic obstructive pulmonary disease，COPD)患者肺組織中的表達(dá)及分布，以探討RON在人類COPD發(fā)病機制中的作用。方法:收集2013年5月至2013年12月在川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心胸外科因肺癌進行手術(shù)治療的患者，將其分為對照組( 25例)和COPD組( 20例)，于手術(shù)切除標(biāo)本中選取距肺癌病灶5 cm以上的新鮮肺組織。采用免疫組化方法觀察兩組患者肺內(nèi)RON蛋白的表達(dá)和分布情況。結(jié)果: COPD組患者肺組織中肺泡區(qū)與支氣管區(qū)RON蛋白的表達(dá)較對照組均明顯增強( P＜0. 05)，而且COPD組患者支氣管區(qū)的RON蛋白表達(dá)量多于肺泡區(qū)( P＜0. 01)結(jié)論: COPD患者肺組織中RON的合成與表達(dá)增強，其表達(dá)量與患者氣流受限嚴(yán)重程度相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】酪氨酸激酶受體RON;慢性阻塞性肺疾病;巨噬細(xì)胞刺激蛋白;肺泡巨噬細(xì)胞

網(wǎng)絡(luò)出版時間: 2016-3-4 10∶16網(wǎng)絡(luò)出版地址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160304.1016.002.html

慢性阻塞性肺疾病( chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以持續(xù)不可逆氣流受限且氣流受限多呈進行性發(fā)展為特征的疾病，與氣道和肺組織對有害顆?；驓怏w的異常慢性炎癥反應(yīng)有關(guān)。COPD的炎癥由多種炎性細(xì)胞、細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)介導(dǎo)且相互作用導(dǎo)致。巨噬細(xì)胞是COPD氣道管壁和管腔的主要炎性細(xì)胞之一。酪氨酸激酶受體RON( recepteur d'origine nantais)是巨噬細(xì)胞刺激蛋白( macrophage stimulating protein，MSP)的特異性受體，在各種免疫細(xì)胞中，RON選擇性表達(dá)于組織巨噬細(xì)胞如肺泡巨噬細(xì)胞表面［1］。MSP激活后與RON結(jié)合并誘導(dǎo)其生物活性，刺激巨噬細(xì)胞釋放氧自由基和炎癥介質(zhì)，誘導(dǎo)核因子-κB( nuclear factor kappa B，NF-κB)的活化，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、遷移和基質(zhì)的侵襲等［2－3］。我們之前的動物實驗發(fā)現(xiàn)［4］:在煙熏建立的COPD大鼠模型中，COPD大鼠肺組織中RON蛋白及其基因的表達(dá)量明顯高于正常大鼠，從而在動物實驗中證實了RON在COPD發(fā)病機制中起一定作用。然而，至今未見RON在人類COPD作用的相關(guān)研究文獻資料。本實驗通過檢測RON 在COPD患者肺組織的表達(dá)及分布，觀察RON是否也在人類COPD發(fā)病中起一定作用。

1 　資料與方法

1.1實驗對象及分組

收集2013年5月至2013年12月在川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心胸外科因肺癌進行手術(shù)治療的患者，將其分為對照組( Control) ( 25例)和COPD組( 20 例)，于手術(shù)切除標(biāo)本中選取距肺癌病灶5 cm以上的新鮮肺組織。標(biāo)本留取大小約2.0 cm×1.0 cm× 1.0 cm，用10%中性甲醛固定24 h后，石蠟包埋，制作蠟塊備用行免疫組化。

COPD組納入標(biāo)準(zhǔn): ( 1)符合衛(wèi)生部醫(yī)政司《慢性阻塞性肺疾病診療規(guī)范( 2011年版)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］; ( 2)肝腎功能正常。排除標(biāo)準(zhǔn): ( 1)呼吸系統(tǒng)其他疾病; ( 2)其他系統(tǒng)疾病如:高血壓病、冠心病、惡性腫瘤、結(jié)締組織病、代謝性疾病、骨關(guān)節(jié)疾病、神經(jīng)肌肉疾病等; ( 3) 6個月內(nèi)接受過手術(shù)治療; ( 4)術(shù)前已進行過放療或化療。

對照組納入標(biāo)準(zhǔn): ( 1)肺功能檢查正常; ( 2)肝腎功能正常。排除標(biāo)準(zhǔn): ( 1)其他呼吸系統(tǒng)疾病; ( 2)其他系統(tǒng)疾病如:高血壓病、冠心病、惡性腫瘤、結(jié)締組織病、代謝性疾病、骨關(guān)節(jié)疾病、神經(jīng)肌肉疾病等; ( 3) 6個月內(nèi)接受過手術(shù)治療; ( 4)術(shù)前已進行過放療或化療。

1.2方法

( 1)一般情況分析:年齡、性別、肺功能等。

( 2)肺功能檢測:選用我院肺功能儀，術(shù)前1周進行肺功能檢測，每次均檢測相同的技術(shù)指標(biāo)，包括FVC、FEV1%、FEV1/FVC%和MVV等肺功能參數(shù)，吸入沙丁胺醇200 μg 15 min后進行肺功能檢測，檢測前24 h不使用支氣管舒張劑。

( 3)免疫組化檢測肺組織RON的表達(dá):采用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物( strept avidin-biotin complex，SABC)法，主要步驟為:切片常規(guī)脫蠟至水，滴加3%H2O2室溫孵育10 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，將切片浸入0.01M枸椽酸鹽緩沖液( pH 6.0)加熱修復(fù)抗原，滴加5% BSA封閉液室溫孵育10 min，滴加適當(dāng)稀釋的兔抗大鼠RON一抗( 1∶200)， 4℃孵育過夜，滴加適當(dāng)稀釋的二抗(生物素化山羊抗兔IgG 1∶100)，37℃孵育30 min，滴加試劑SABC ( 1∶100) 37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

( 4)免疫組化結(jié)果判斷:在OLYMPUS DP70顯微鏡高倍鏡視野下觀察，陽性:棕黃色或黃色顆粒表達(dá)于細(xì)胞胞漿和(或)胞膜上。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖文分析軟件，于每張免疫組化染色片的肺泡區(qū)和支氣管區(qū)各隨機不重復(fù)采圖5張，測量每張圖片肺泡區(qū)和支氣管區(qū)的平均光密度值，再取其平均值作為該患者肺泡或支氣管組織RON蛋白表達(dá)含量進行統(tǒng)計分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0進行處理，服從正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較采用t檢驗;不服從正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)(四分位間距)表示，即M( QR)，兩組間比較采用成組設(shè)計兩樣本秩和檢驗或配對設(shè)計符號秩和檢驗;性別差異比較采用卡方檢驗。相關(guān)性分析采用Spearson相關(guān)。檢驗水準(zhǔn)設(shè)為:α= 0. 05。

2　結(jié)果

2.1一般情況比較

兩組患者年齡、性別比較無顯著性差異( P＞0. 05)。COPD組的FEV1/FVC%及FEV1%較對照組均明顯降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義( P均＜0.01) (表1)。

表1　受試者一般情況比較［x±s或M( QR)］

2.2肺組織中RON蛋白的比較

肺組織免疫組化結(jié)果顯示:在肺泡區(qū)，RON蛋白表達(dá)于COPD患者的大部分肺泡上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿內(nèi)，呈明顯的棕黃色或黃色顆粒樣改變(圖1)，而對照組僅部分肺泡上皮細(xì)胞的胞膜和胞漿內(nèi)見淡黃色顆粒的RON蛋白表達(dá)(圖2)。在支氣管區(qū)，RON蛋白表達(dá)于COPD患者大部分支氣管柱狀上皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的胞膜和胞漿內(nèi)，呈明顯的棕黃色或黃色顆粒樣改變(圖3)，而對照組僅部分支氣管柱狀上皮細(xì)胞的胞膜或胞漿內(nèi)見淡黃色顆粒的RON蛋白表達(dá)(圖4)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，COPD組肺泡區(qū)、支氣管區(qū)平均光密度值均顯著高于對照組，有顯著統(tǒng)計學(xué)意義( P＜0. 05) ; COPD組的支氣管區(qū)平均光密度值顯著高于肺泡區(qū)，其差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義( P＜0. 01) ;而對照組的支氣管區(qū)平均光密度值與肺泡區(qū)比較則無統(tǒng)計學(xué)意義( P＞0. 05) (表2)。2．3 COPD患者肺組織中RON蛋白表達(dá)量與肺功能的相關(guān)分析

表2　兩組患者肺組織中RON蛋白的比較［平均光密度，M(QR)］

圖1　COPD組肺泡區(qū)RON表達(dá)：肺泡Ⅰ型細(xì)胞（，肺泡Ⅱ型細(xì)胞（　），肺泡巨噬細(xì)胞（）（SABC×1000）

圖2　對照組肺泡區(qū)RON表達(dá)：肺泡Ⅰ型細(xì)胞（，肺泡Ⅱ型細(xì)胞（　），肺泡巨噬細(xì)胞（?。⊿ABC×1000）

圖3　COPD組支氣管區(qū)RON表達(dá)：肺泡巨噬細(xì)胞（，支氣管假復(fù)層纖毛柱狀上皮細(xì)胞（），（SABC×1000）

COPD患者肺泡區(qū)及支氣管區(qū)RON蛋白表達(dá)量水平與肺功能的FEV1%均呈負(fù)相關(guān)(表3)。

表3　COPD患者肺組織中RON蛋白表達(dá)量與FEV1%相關(guān)性

圖4　對照組支氣管區(qū)RON表達(dá)：支氣管假復(fù)層纖毛柱狀上皮細(xì)胞（），肺泡巨噬細(xì)胞（）（SABC×1000）

3　討論

酪氨酸蛋白激酶受體RON是MSP的特異性受體。而且MSP為目前已知的受體型酪氨酸蛋白激酶RON的唯一特異性配體［6－7］。RON的分布與表達(dá)僅限于在上皮起源性細(xì)胞中［8］。研究顯示，在成年大鼠除了脾臟和心臟外的各器官中均可見RON的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)［9］。另有研究發(fā)現(xiàn)［10］，在正常甲狀腺細(xì)胞中幾乎檢測不到RON。RON激活的方式有兩種，即配體依賴和配體非依賴方式。( 1)配體依賴方式:在病理狀況下，pro-MSP經(jīng)酶水解后，在細(xì)胞表面形成成熟的雙鏈蛋白MSP與RON結(jié)合后，RON的SEMA域與MSP的β鏈(主要的受體結(jié)合位點［7，11］)以“酶-底物”模式結(jié)合而引起RON受體分子同源二聚化，從而誘導(dǎo)其磷酸化和激酶的生物活性，RON構(gòu)象發(fā)生變化，C末端產(chǎn)生特殊的結(jié)合信息分子的多功能錨定位點。多功能錨定位點是RON與下游信息分子接觸、傳遞信息的重要結(jié)構(gòu)點［12］; ( 2)配體非依賴方式: RON也能在沒有配體MSP存在的情況下進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過整合素介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)( extracellular matrix，ECM) (如Ⅳ型膠原)間的黏附也能引起RON發(fā)生自身磷酸化而激活。活化的RON激活多種信號蛋白，通過不同的級聯(lián)途徑向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)各種信號，如Ras/絲裂原活化蛋白激酶( mitogen activated protein kinase，MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶( phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K) /AKT、jun N-末端激酶( jun N-terminal kinase，JNK) /應(yīng)激激活蛋白激酶、β-catenin、Smad和NF-κB分子等，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、遷移、轉(zhuǎn)化和分化［13］。

本研究通過免疫組化方法發(fā)現(xiàn)COPD和對照組患者肺組織中肺泡上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和氣管支氣管纖毛柱狀上皮細(xì)胞中均有RON蛋白表達(dá)，但COPD組肺組織中肺泡區(qū)與支氣管區(qū)RON蛋白的表達(dá)明顯強于對照組，兩組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。提示COPD患者肺組織中RON的合成和表達(dá)增強。這與動物實驗研究結(jié)果一致［4］。進一步通過相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，COPD患者肺組織中RON蛋白表達(dá)量水平與肺功能的FEV1%呈負(fù)相關(guān)( r絕對值＞0. 5)。提示，隨著RON蛋白表達(dá)量增加，COPD患者FEV1%逐漸降低，因此，我們推測RON在COPD發(fā)生發(fā)展中起一定的作用，且與COPD的氣流受限嚴(yán)重程度相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，COPD組的支氣管區(qū)RON蛋白表達(dá)量多于肺泡區(qū)，然而在對照組中的氣管區(qū)RON蛋白表達(dá)量與肺泡區(qū)相差不大，也就是說在COPD患者中，RON更多表達(dá)在氣管支氣管的上皮細(xì)胞中。這提示RON更多參與的是氣道的炎癥機制。

本試驗顯示，COPD患者肺泡上皮細(xì)胞及氣道上皮細(xì)胞中有較高的MSP受體RON表達(dá)，而活化的MSP與RON相結(jié)合后可激活信號通路參與炎癥反應(yīng)如刺激氣道炎性細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)如白細(xì)胞介素-6( Interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素-8( Interleukin-6，IL-8)、腫瘤壞死因子-α( Tumor Necrosis Factor-alpha，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1 β( Interleukin-1 beta，IL-1 β)等增多［14］。提示RON在COPD的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，可能主要是參與氣道炎癥的調(diào)節(jié)。

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(學(xué)術(shù)編輯:杜飛)

呼吸系統(tǒng)疾病研究專題·論著

The expression and significance of RON receptor tyrosine kinase in chronic obstructive pulmonary disease patients

ZHANG Wen-bo，CHEN Xiao-ju，XIANG Xiao-jun，LENG Chang-yan
( Department of Respiratory Medicine，Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，Sichuan，China)

【Abstract】Objective: To evaluate the role of receptor tyrosine kinase RON in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease( COPD)，we observed the expression and distribution of RON in the lung tissue of people suffering from COPD.Methods: The lung tissue samples were obtained from 20 COPD patients and 25 controls with operation because of lung cancer in North Sichuan Medical College Affiliated Hospital from May 2013 to December 2013.The expression and distribution of RON protein in the lung tissue of each group was observed by immunohistochemistry.Results: The levels of RON protein in the bronchus region and alveolar region of the lung from the COPD patients were outstandingly higher than those of the control( P＜0. 05)，and the expression of RON protein in COPD patients bronchus region was more than the alveolar region.Conclusion: The expression of RON protein in lung tissue of the patients with COPD is stronger.The expression levels of RON protein in lung tissue of the COPD patients are related to the severity of airflow limitation.

【Key words】Receptor tyrosine kinase RON; Chronic obstructive pulmonary disease; Macrophage stimulating protein; Alveolar macrophage ( AM)

作者簡介:張文波( 1982－)，男，碩士研究生，住院醫(yī)師。通訊作者:陳小菊，E-mail: cxj9592@163.com

基金項目:四川省衛(wèi)生廳科研項目( 070293)

收稿日期:2015－05－25

doi:10. 3969/j. issn. 1005-3697. 2016. 01.01

【文章編號】1005-3697( 2016) 01-0002-04

【中圖分類號】R563

【文獻標(biāo)志碼】A