楊秀華，孟　濤

(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科，遼寧沈陽　110001)

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TGF-β2和TGFβRⅡ在子癇前期胎盤中的表達*＊?

楊秀華，孟濤＊＊

(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科，遼寧沈陽110001)

［摘要］目的:檢測子癇前期(Pre-eclampsia，PE)胎盤組織中轉(zhuǎn)化生長因子-β2(TGF-β2)和受體TGFβRⅡmRNA和蛋白的表達。方法:正常足月剖宮產(chǎn)孕婦30例為對照組，子癇前期剖宮產(chǎn)孕婦30例(20例足月妊娠、10例未足月妊娠)為子癇前期組，比較兩組孕婦的年齡、孕周、胎盤重量及新生兒重量，采用Real-time PCR、Western blot和免疫組織化學方法檢測娩出胎盤組織的TGF-β2及TGFβRⅡ的mRNA和蛋白表達。結(jié)果:子癇前期孕婦胎盤重量及新生兒體重均低于對照組(P＜0.05) ;子癇前期孕婦胎盤組織中TGF-β2和TGFβRⅡ的mRNA和蛋白表達水平均顯著高于對照組孕婦胎盤組織(P＜0.05) ;免疫組化顯示子癇前期胎盤中TGF-β2和TGFβRⅡ的陽性率均高于對照組孕婦的胎盤組織(P＜0.05)。結(jié)論:子癇前期胎盤組織中TGF-β2及TGFβRⅡ升高可能與子癇前期的發(fā)生有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］子癇;前期;轉(zhuǎn)化生長因子β;受體，轉(zhuǎn)化生長因子β;免疫組織化學

＊＊通信作者E-mail: cmumt@163.com

網(wǎng)絡出版時間: 2016－02－23網(wǎng)絡出版地址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160223.1842.010.html

子癇前期(Pre-eclampsia，PE)發(fā)病率為7%～10%，是導致我國孕產(chǎn)婦死亡的主要原因，其病因和發(fā)病機制尚未完全明了，目前認為與母胎界面滋養(yǎng)細胞淺植入導致的胎盤功能不良有關(guān)。孕早期絨毛外滋養(yǎng)細胞(extravillous trophoblasts，EVTs)從固定絨毛中長出，侵襲至母體蛻膜并重塑子宮螺旋動脈，孕早期EVT侵襲不足與妊娠合并癥如子癇前期有關(guān)。轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growthfactor-beta，TGF-β)是一組研究較為廣泛的細胞因子，由TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3組成，TGF-β通過與細胞表面受體TGFβⅠ、TGFβⅡ和TGFβⅢ結(jié)合發(fā)揮生物學功能。TGF-β可抑制滋養(yǎng)細胞的浸潤和遷移，同時參與胎盤的形成，在胎盤和胚胎的生長發(fā)育中起一定作用［1］，其表達異?？赡芘c子癇前期的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。研究認為，TGF-β1在子癇前期胎盤組織中表達增高，但TGF-β2在子癇前期中的研究較少。本文擬通過觀察TGF-β2其受體TGFβRⅡ在子癇前期胎盤中的表達，探討這兩種細胞因子在子癇前期發(fā)病中的作用。

1　材料與方法

1.1一般資料

收集2013年1月～2015年9月剖宮產(chǎn)分娩的子癇前期孕婦30例，包括足月20例，未足月10例，子癇前期輕度和重度各15例;選取同期剖宮產(chǎn)的正常足月妊娠孕婦30例為對照組。所有產(chǎn)婦均為初產(chǎn)婦，孕前及孕后無其他合并癥和并發(fā)癥，依據(jù)第八版《婦產(chǎn)科學》診斷子癇前期。所有研究對象知情同意參加研究，實驗得到醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2主要試劑

TGF-β2和TGFβRⅡ引物由上海Sangon生物工程公司合成，TRIZOL和SYBR Primescript RTPCR試劑盒購自大連寶生物公司，鼠抗人TGF-β2單克隆抗體、鼠抗人TGFβRⅡ單克隆抗體和鼠抗人GAPDH單克隆抗體購自美國Abcam公司。

1.3檢測TGF-β2 mRNA及TGFβRⅡmRNA

Real-time PCR檢測胎盤組織中TGF-β2 mRNA和TGFβRⅡmRNA水平。用TRIZOL一步法提取總RNA，以GAPDH作為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCT計算相對表達量。引物序列TGF-β2上游為5'-ATGTGCAGGATAATTGCTGCC-3'，下游為5'-TGGTGTTGTACAGGCTGAGG-3'; TGFβRⅡ上游為5'-TTTCCACCTGTGACAACC-3'，下游為5'-TGACAGATATGGCAACTC-3'; GAPDH上游為5'–TCGACAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3'，下游為5'-ACCAAATCCGTTGACTCCGACCTT-3'。每個樣品設置3個重復孔，實驗重復3次。程序: 95℃，10 min，40個PCR循環(huán); 95℃，5 s; 60℃，34 s(收集熒光)。

1.4檢測TGF-β2蛋白及TGFβRⅡ蛋白

1.4.1 Western blot Western blot檢測子癇前期和正常胎盤組織中TGF-β2和TGFβRⅡ的蛋白水平。從胎盤中提取蛋白，蛋白濃度測定采用考馬斯亮藍G250方法。選取50 μg總蛋白進行變性5 min，再行SDS-聚丙烯酞胺凝膠電泳(SDSPAGE)進行蛋白檢測，用80 V恒壓2 h后轉(zhuǎn)移到PVDF膜。將PVDF膜移至含有封閉液(TBST配制0.5% 0脫脂奶粉)平皿中，室溫下脫色，搖床上搖動封閉2 h。置入2 mL/L的TGF-β2特異抗體和1 mg/L的TGFβII抗體，在4℃脫色搖床上過夜，以同樣方法用TBST緩沖液按比例稀釋第二抗體并與膜接觸，室溫下孵育2 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次15 min?；瘜W發(fā)光法(ECL)顯帶，利用Image J軟件分析條帶相對表達值。以GAPDH作為內(nèi)參。

1.4.2免疫組織化學免疫組織化學檢測子癇前期和正常胎盤組織中TGF-β2和TGFβRⅡ的蛋白表達。將切片常規(guī)脫蠟和水化后在高溫高壓條件下進行抗原修復，以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知的TGF-β2和TGFβRⅡ表達陽性的乳腺癌組織做陽性對照，以胞質(zhì)呈棕黃色顆粒沉著為染色陽性，按照染色強度和染色陽性細胞的數(shù)量進行強度分級。染色強度:基本不染色0分，染色淡黃1分，染色適中2分，深染3分。染色陽性細胞數(shù):＜10%為0分，10%～25%為1分，＞25%～≤50% 為2分，＞50%為3分。將每張切片的2項評分相加，0～1分代表低表達，≥2分代表高表達。

1.5統(tǒng)計學分析

利用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，基因的相對表達水平用均數(shù)±標準差表示，各組數(shù)據(jù)間的比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2　結(jié)果

2.1病例資料

正常孕婦組與子癇前期組年齡和孕周比較無統(tǒng)計學差異，子癇前期孕婦組胎盤質(zhì)量明顯低于對照孕婦組(P＜0.05)，子癇前期組新生兒體重明顯低于對照組(P＜0.05)，見表1。

2.2 TGF-β2 mRNA和TGFβRⅡmRNA

TGF-β2 mRNA在正常胎盤中的表達量為0.84±0.25，子癇前期胎盤中表達量升高，為1.14 ±0.27，兩者比較有顯著差異(P＜0.05) ; TGFβR ⅡmRNA在正常胎盤中的表達量為0.79±0.20，子癇前期胎盤中表達量升高，為1.20±0.31，兩者比較有顯著差異(P＜0.05)。見圖1。

表1　兩組孕婦年齡、孕周、胎盤重量及新生兒體重比較(±s)Tab.1　Comparison of gravidas age，gestational weeks，placenta weight and neonatal weight between the two groups

表1　兩組孕婦年齡、孕周、胎盤重量及新生兒體重比較(±s)Tab.1　Comparison of gravidas age，gestational weeks，placenta weight and neonatal weight between the two groups

(1)P＜0.05

病例資料　　正常妊娠組(n =30)子癇前期組(n =30)年齡(歲)27.5±2.2　28.4±2.5孕周(周)　38.5±1.5　36.5±1.2胎盤重量(g)　 578.5±98.5　 530.0±80.5(1)新生兒體重(g)　 3 340.0±405.0　 2 450.0±425.0(1)

(1)P＜0.05圖1　胎盤組織中TGF-β2 mRNA和TGFβRⅡ表達(Real-time PCR)Fig.1 The mRNA expression of TGF-β2 and TGFβRⅡin placenta tissues

2.3 TGF-β2蛋白和TGFβRⅡ蛋白

Western blot檢測結(jié)果顯示，TGF-β2在正常胎盤中的蛋白表達量為0.92±0.29，子癇前期胎盤中表達量為1.23±0.32，兩者比較有顯著差異(P ＜0.05) ; TGFβRⅡ在正常胎盤中的蛋白表達量為0.72±0.25，子癇前期胎盤中表達量為1.31± 0.28，兩者比較有顯著差異(P＜0.05)。見圖2。

(1)P＜0.05圖2　胎盤組織TGF-β2蛋白及TGFβRⅡ蛋白表達(Western biot)Fig.2 The protein expression of TGF-β2 and TGFβRⅡin placenta tissues

免疫組化染色結(jié)果(圖3)提示TGF-β2蛋白及TGFβRⅡ蛋白主要表達于胎盤絨毛滋養(yǎng)細胞，表達部位主要在細胞漿。在子癇前期組、正常胎盤組中TGF-β2的陽性表達率分別為66.67% (20/ 30)、20.00%(6/30)，TGFβRⅡ的陽性表達率分別為53.33% (16/30)、16.67% (5/30)。TGF-β2和TGFβRⅡ在子癇前期組中的表達均明顯高于正常胎盤組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

注: A、B為TGF－β2，C、D為TGFβ RⅡ; A、C為對照，B、D為PE圖3　胎盤絨毛滋養(yǎng)細胞中TGF-β2蛋白和TGFβRⅡ蛋白表達(免疫組化，×200)Fig.3 Expression of TGF-β2 and TGFβRⅡof the specimens by immunohistochemistry SP method

3　討論

正常胎盤的發(fā)育依賴于子宮螺旋動脈的生理性重鑄。早期妊娠時絨毛外滋養(yǎng)細胞從固定絨毛中侵襲到子宮內(nèi)膜蛻膜層和子宮肌層，絨毛外滋養(yǎng)細胞侵襲分兩步，第一步是妊娠8～10周侵襲到子宮螺旋動脈蛻膜，第二步是妊娠16～18周侵襲到子宮肌層。子癇前期是導致孕產(chǎn)婦死亡的主要原因之一，與滋養(yǎng)細胞侵襲和子宮螺旋動脈重鑄障礙有關(guān)。在產(chǎn)科領(lǐng)域，TGF-β通路可抑制滋養(yǎng)細胞侵襲和遷移［2－3］。子癇前期患者血清中TGF-β表達升高，并抑制組織中VEGF的表達［4－6］，另有研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期患者胎盤中TGF-β通路基因DNA甲基化明顯增高［7］。周仲元等［8］報道，子癇前期孕婦胎盤和血漿中的TGF-β1含量均明顯升高。Deepthi等［9］認為TGF-β1是子癇前期分子病理中一個關(guān)鍵的基因，它不僅能夠調(diào)節(jié)靶細胞的血管生成和凋亡，而且可以控制TH1/TH2細胞因子平衡，并產(chǎn)生抗炎性外周調(diào)節(jié)T細胞。師海英等［10］發(fā)現(xiàn)，TGF-β3在早孕期妊娠組織中有表達，子癇前期胎盤中TGF-β3表達增高，然而子癇前期胎盤組織中TGF-β2的表達情況報道較少。

本研究結(jié)果顯示，子癇前期胎盤組織中TGF-β2的mRNA和蛋白表達水平均高于正常胎盤，提示TGF-β2可能參與子癇前期的發(fā)生。免疫組化、RT-PCR、Western blot和ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，在早孕期胚胎組織中有TGF-β2持續(xù)表達，提示這種細胞因子可能在滋養(yǎng)細胞侵襲中發(fā)揮作用［3］。早期胎盤發(fā)育過程中低氧環(huán)境對于EVT侵襲很重要［11］，而這種低氧環(huán)境對于EVT的侵襲作用依賴于TGF-β超家族成員。研究者利用高通量定量方法在2-D早孕期EVT侵襲模型研究中發(fā)現(xiàn)，外源性增加TGF-β2的表達可使EVT侵襲范圍減小，說明TGF-β2在早孕期抑制EVT侵襲［12］;也有研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期患者血清中TGF-β2表達增高，并被認為是子癇前期的預測指標［13］。目前考慮子癇前期胎盤中TGF-β2升高的原因部分是由于TGF-β2抑制EVT侵襲，使子宮螺旋動脈生理性重鑄受限，使滋養(yǎng)細胞的浸潤能力下降，導致其對子宮肌層和螺旋小動脈的浸潤程度降低，引發(fā)子癇前期。

TGF-β2發(fā)揮作用時需要TGFβRⅡ存在，有研究表明，TGF-β2與其受體TGFβRⅡ作用后，通過TGF-β/Smads信號通路來調(diào)控滋養(yǎng)細胞的增殖、免疫、分化和內(nèi)分泌［14］。尚麗新等［15］利用免疫組化方法也證實在正常妊娠和妊娠期高血壓疾病胎盤滋養(yǎng)細胞和蛻膜中均存在TGFβRⅡ，且妊娠期高血壓疾病胎盤中TGFβRⅡ表達高于正常，與本研究結(jié)果相一致。

本研究通過免疫組化方法探討了子癇前期和正常胎盤中TGF-β2和TGFβRⅡ的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β2和TGFβRⅡ在正常孕婦組和子癇前期孕婦組胎盤組織中都有表達，但兩者在子癇前期孕婦組的陽性表達率都高于正常對照組孕婦，提示子癇前期存在TGF-β2和TGFβRⅡ表達異常，這種表達異常和子癇前期的因果關(guān)系值得進一步研究。TGF-β2和TGFβRⅡ表達部位主要在胎盤的絨毛滋養(yǎng)細胞，提示TGF-β2可通過TGFβRⅡ來調(diào)控滋養(yǎng)細胞的增殖與分化，在胚胎著床和繼續(xù)妊娠過程中發(fā)揮作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，在TGF-β2表達陽性的子癇前期孕婦的胎盤中TGFβRⅡ表達也多為陽性，在TGF-β2表達陰性的正常胎盤中TGFβRⅡ表達也多為陰性，兩者呈相似的表達趨勢，說明TGF-β2和TGFβRⅡ作用一致，共同調(diào)控滋養(yǎng)細胞的侵襲能力。

綜上，TGF-β2和TGFβRⅡ表達增高可抑制滋養(yǎng)細胞侵襲，使子宮胎盤的血流下降，導致滋養(yǎng)細胞植入變淺和異常的子宮胎盤血管重鑄，引起子癇前期的發(fā)生。目前關(guān)于TGF-β2及其受體TGFβRⅡ的信號通路尚不清楚，深入探討二者的相互作用可進一步揭示子癇前期的病因，為子癇前期的診治提供理論依據(jù)。有效調(diào)控TGF-β2及其受體TGFβRⅡ的表達可能為預防和治療子癇前期提供一條新的途徑。由于本實驗樣本量偏少，仍需進一步探討。

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(2015－10－22收稿，2015－12－30修回)

中文編輯:潘婭;英文編輯:周凌

Expression and Significance of TGF-β2 and TGFβRⅡin Placenta of Pre-eclampsia Patients

YANG Xiuhua，MENG Tao
(Department of Obstetrics，the First Hospital Affiliated to China Medical University，Shenyang 110001，Liaoning，China)

［Abstract］Objective: To investigate the mRNA and protein expression levels of transforming growth factor beta-2 (TGF-β2) and transforming growth factor beta receptor 2 (TGFβRⅡ) in placentas of pre-eclampsia (PE) patients.Methods: Thirty cases of normal gravidas served as control group and 30 cases of PE patients as PE group.Gravidas age，gestational weeks，placenta weight and neonatal weight between the two groups were compared.The mRNA and protein expression levels of TGF-β2 and TGFβRⅡof the specimens were determined by real-time PCR，Western blot and immunohistochemistry.Results: The placenta and neonatal weight of PE group were lower than those of control group(P＜0.05) ; TGF-β2 and TGFβRⅡmRNA and protein levels in PE group were significantly higher than those of control group (P＜0.05) ; The positive expression rates of TGF-β2 and TGFβRⅡin PE group were significantly higher than those of normal placentas detected by immunohistochemistry method(P＜0.05).Conclusion: The high expression levels of TGF-β2 and TGFβRⅡmight be related to the aetiology of PE.

［Key words］eclampsia; prophase; transforming growth factor β; receptor，transforming growth factor; immunohistochemistry

*［基金項目］國家自然科學基金(81270711)

［中圖分類號］R714.24

［文獻標識碼］A

［文章編號］1000-2707(2016) 02-0185-05