李　妍，李　鋒，曹珂珂，王明杰，王　娣，許　暉

1.蚌埠學(xué)院食品與生物工程系，安徽蚌埠，233030；

2.南京軍區(qū)總醫(yī)院血液科，江蘇南京，210002

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響應(yīng)面法優(yōu)化大孔樹(shù)脂純化山藥多糖工藝

李妍1，李鋒2，曹珂珂1，王明杰1，王娣1，許暉1

1.蚌埠學(xué)院食品與生物工程系，安徽蚌埠，233030；

2.南京軍區(qū)總醫(yī)院血液科，江蘇南京，210002

摘要：針對(duì)一般方法較難純化山藥多糖，選擇不同型號(hào)大孔樹(shù)脂，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理、三因素三水平響應(yīng)面分析法，以靜態(tài)吸附率為指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)，模擬二次多項(xiàng)式回歸方程的預(yù)測(cè)模型，確定最佳吸附條件：吸附溫度為29.29℃、D101加入量為2.5 g和吸附時(shí)間19.67 h。此條件下，最佳吸附率為67.39%，解吸附實(shí)驗(yàn)得出解吸附率為77.52%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠。

關(guān)鍵詞：山藥多糖；響應(yīng)面法；大孔樹(shù)脂；靜態(tài)吸附；解吸

山藥(Rhizomadioscoreae)為薯蕷科(Dioscoreaceae)多年生宿根蔓性草本植物[1]，其地下塊莖具有補(bǔ)腎、健胃、補(bǔ)脾、止瀉、益精、化痰等功效，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源植物。山藥中含有多糖、淀粉、淀粉酶、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、皂苷、膽堿以及多種微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分，其中多糖是山藥的主要生物活性成分，具有多種功能[2-4]。近些來(lái)，藥物多糖已為規(guī)避治療腫瘤常規(guī)的化療開(kāi)辟了新的研究領(lǐng)域[5]，越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始關(guān)注植物多糖的提取。目前，山藥多糖的提取和純化技術(shù)工藝水平還不完善，需要學(xué)界進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化大孔樹(shù)脂純化山藥多糖，以期得到較好的山藥多糖純品。

1材料與方法

1.1材料與試劑

市購(gòu)水山藥，粉碎，過(guò)40目篩，密封儲(chǔ)存于磨口玻璃瓶中，備用。

葡萄糖、苯酚、濃硫酸、95%乙醇、無(wú)水乙醇、氯仿、正丁醇、乙醚、丙酮、石油醚、氫氧化鈉、鹽酸，均采用分析純?cè)噭?；大孔?shù)脂(D101，AB-8，NKA-Ⅱ)購(gòu)自天津大學(xué)化工廠。

1.2儀器與設(shè)備

氣浴恒溫振蕩器SHZ-82(金壇市杰瑞爾電器有限公司)，JK-800DB型數(shù)控超聲清洗器(合肥金尼克機(jī)械制造有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-2000B(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-1(金壇市杰瑞爾電器有限公司)，電子天平AB323(上海?？惦娮觾x器廠)，722可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)，XFB-200高速中藥粉碎機(jī)(吉首市中誠(chéng)制藥機(jī)械廠)。

1.3試驗(yàn)方法1.3.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1 g葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL容量瓶中定容，搖勻；再移取10 mL于100 mL容量瓶中定容，搖勻，得到0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液；從中移取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于試管中，分別加入蒸餾水至2 mL，再加入5%苯酚溶液1 mL，后迅速滴加5.0 mL濃硫酸搖勻。將7份樣品置于水浴鍋中沸水浴15 min，冷卻后在490 nm下測(cè)量吸光度。以葡萄糖溶液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到線(xiàn)性回歸方程：y=11.036x-0.0015，R2=0.9995，見(jiàn)圖1。

1.3.2超聲水提取山藥多糖1.3.3大孔樹(shù)脂的選取

選取處理過(guò)的大孔樹(shù)脂D101，AB-8，NKA-Ⅱ加入1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液， 25℃恒溫振蕩25 h。利用苯酚-硫酸法計(jì)算得出山藥多糖的濃度，進(jìn)而計(jì)算出大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附率[4]，見(jiàn)下式①②。

用80%乙醇溶液在25℃恒溫振蕩24 h回收大孔樹(shù)脂，計(jì)算得出靜態(tài)解吸附率，如下式③。

吸附容量CA[mg/(g·樹(shù)脂)]=[(C0-C1)

×V1]/m1

①

吸附率=[(C0-C1)/C0]×100%

②

解吸附率t=[(C2×V1)/(m1×CA)]×100%

③式中，C0為初始葡萄糖液的質(zhì)量濃度(mg/mL)，C1為吸附后上清液中葡萄糖的質(zhì)量濃度(mg/mL)，C2為解吸液中葡萄糖的質(zhì)量濃度(mg/mL)，V1為樣液的體積(mL)，m1為樹(shù)脂干質(zhì)量(g)，CA為吸附容量(mg/g)。

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

1.3.4大孔樹(shù)脂吸附率的單因素實(shí)驗(yàn)1.3.4.1響應(yīng)面法對(duì)靜態(tài)吸附條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Benhnken設(shè)計(jì)，以大孔樹(shù)脂D101的靜態(tài)吸附率為考察目標(biāo)，分別以樹(shù)脂加入量、吸附時(shí)間、吸附溫度為三因素。實(shí)驗(yàn)因素水平編碼見(jiàn)表1。

表1　響應(yīng)面分析因子及水平表

1.3.4.2解吸附

分別用蒸餾水,40%、50%、60%、70、80%、90%、100%乙醇各30 mL進(jìn)行解吸附，比較解吸附率。

1.3.4.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按照最佳吸附條件做三組平行實(shí)驗(yàn)，取平均值，比較靜態(tài)吸附率；根據(jù)最佳解吸附結(jié)果，用最佳解吸附條件做三組平行實(shí)驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1大孔樹(shù)脂的選取

三種大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附與解吸附結(jié)果見(jiàn)表2。D101與AB-8的靜態(tài)吸附率與解析率相差不大，均比NKA-Ⅱ效果好，其中D101的靜態(tài)吸附率略低于AB-8，但解析率比AB-8高，因此綜合考慮，D101效果更好。

表2　三種大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附與解吸附

2.2單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析2.2.1大孔樹(shù)脂加入量對(duì)靜態(tài)吸附的影響

在氣浴恒溫振蕩器中振蕩吸附24 h、溫度為25℃的條件下，得到不同大孔樹(shù)脂量與靜態(tài)吸附的關(guān)系，如圖2。隨著樹(shù)脂加入量增加，靜態(tài)吸附逐漸提高，并且趨勢(shì)逐漸變緩。

圖2　樹(shù)脂加入量對(duì)靜態(tài)吸附的影響結(jié)果

2.2.2吸附時(shí)間對(duì)靜態(tài)吸附的影響

在溫度為25℃、樹(shù)脂加入量為2.5 g的條件下，得到不同時(shí)間對(duì)大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附的關(guān)系，如圖3。時(shí)間在6～12 h之間，靜態(tài)吸附率隨時(shí)間增加而快速增加，12 h后變化不明顯。

圖3　吸附時(shí)間對(duì)靜態(tài)吸附影響結(jié)果

圖4　溫度對(duì)靜態(tài)吸附影響結(jié)果

2.2.3吸附溫度對(duì)靜態(tài)吸附的影響

在氣浴恒溫振蕩器中振蕩吸附24 h、樹(shù)脂加入量為2.5 g的條件下，得到不同溫度對(duì)大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附的關(guān)系，如圖4。隨著吸附溫度的增加，靜態(tài)吸附率的變化不大，所以吸附溫度對(duì)靜態(tài)吸附率無(wú)明顯的影響。

2.3響應(yīng)面法設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取有效影響范圍，設(shè)計(jì)出三因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)表3。

表3　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4　回歸方程方差分析表

注：*表示影響顯著(0.01

運(yùn)用Design Expert軟件分析，以吸附溫度、吸附時(shí)間和D101加入量為響應(yīng)變量，以靜態(tài)吸附率為響應(yīng)值，進(jìn)行回歸擬合分析，可得到模型如下：

Y=66.34+0.56A+2.99B+0.80C-0.82A2-2.67B2-0.79C2-0.45AB+0.28AC-0.18BC

表中，F(xiàn)A=8.82，F(xiàn)B=248.72，F(xiàn)C=17.84，所以各因素對(duì)靜態(tài)吸附率的影響程度大小為：吸附時(shí)間>D101加入量>吸附溫度。

響應(yīng)面法優(yōu)化D101對(duì)山藥多糖靜態(tài)吸附率的最佳方案：吸附溫度29.29℃，吸附時(shí)間19.67 h，D101加入量為2.50 g，此條件下理論靜態(tài)吸附率為67.39%。

采用交互作用組圖即可對(duì)兩兩因素交互影響山藥多糖吸附率的效應(yīng)進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)。由圖5可以看出，3個(gè)響應(yīng)曲面開(kāi)口均近視為向下的凸形曲面，并且等高線(xiàn)中最小橢圓的中心在所選的-1～1范圍內(nèi)，說(shuō)明響應(yīng)值在3個(gè)因子設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)存在最大值。分析各圖，兩兩因素的交互關(guān)系均不明顯，說(shuō)明各因素間交互效應(yīng)不顯著，比較幾個(gè)圖可以看出，B(即吸附時(shí)間)對(duì)響應(yīng)值的影響最大，表現(xiàn)為Y值的變換最大。

圖5　兩因素交互作用對(duì)吸附率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖

2.4解吸附結(jié)果分析

對(duì)大孔樹(shù)脂D101分別用不同濃度的乙醇溶液進(jìn)行解吸附，得出如圖6結(jié)果。從中可以看出，D101的解吸附率先是隨著乙醇濃度的提高而增加，后逐漸減少，在80%濃度下達(dá)到解吸附率最大值78.8%。

圖6 乙醇濃度對(duì)解吸附率的影響

2.5驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

響應(yīng)面法分析得到山藥多糖的最佳純化工藝，然后進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。選擇溫度為30℃、吸附時(shí)間為19.5 h、D101加入量為2.5 g的條件進(jìn)行三組平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5。

表5　山藥多糖大孔樹(shù)脂純化驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3結(jié)論

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分析三種大孔樹(shù)脂D101、AB-8和NKA-Ⅱ的綜合吸附與解吸附，得出最佳大孔樹(shù)脂為D101；單因素實(shí)驗(yàn)得出，樹(shù)脂加入量(即D101加入量)與吸附時(shí)間均對(duì)靜態(tài)吸附率產(chǎn)生影響，而吸附溫度則影響不大。由響應(yīng)面法分析得出，山藥多糖的純化條件為：吸附溫度29.29℃、吸附時(shí)間19.67 h、D101加入量為2.50 g。在此條件下，得出最大靜態(tài)吸附率為67.39%；由解吸附實(shí)驗(yàn)得出，大孔樹(shù)脂D101最佳解吸附的乙醇濃度為80%。在此條件下山藥多糖的純化率較好，結(jié)果穩(wěn)定可靠。

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(責(zé)任編輯：汪材印)

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ461

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-2006(2016)02-0112-04

作者簡(jiǎn)介：李妍(1982-)，女，安徽蚌埠人，碩士，助教，主要研究方向:天然藥物的提取與分離純化。

基金項(xiàng)目：蚌埠學(xué)院重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目“農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏”；安徽省教育廳省級(jí)質(zhì)量工程項(xiàng)目“卓越工程計(jì)劃——食品質(zhì)量與安全”(2013zyjh040)。

收稿日期：2015-11-12

doi:10.3969/j.issn.1673-2006.2016.02.031