文　欣，劉寶寧，周成旭，蔣　瑩，陳航霞

寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波　315211

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顆石藻Pleurochrysis carterae抗捕食特征

文欣，劉寶寧，周成旭*，蔣瑩，陳航霞

寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波315211

摘要:顆石藻Pleurochrysis carterae是沿海水域中常見鈣化微藻，易形成高密度水華，也是養(yǎng)殖環(huán)境致害種之一?？共妒撤烙芰赡苁瞧浞N群增殖優(yōu)勢(shì)的一個(gè)重要原因。以鹵蟲作為捕食者，分析了顆石藻P.carterae抗捕食現(xiàn)象，以及在捕食壓力下的重要生理生化響應(yīng)特征，以期為顆石藻P.carterea抗捕食機(jī)制研究及其高密度增殖機(jī)理提供參考。研究結(jié)果顯示:(1)當(dāng)顆石藻P.carterae比例增加時(shí)，鹵蟲對(duì)微藻的攝食率顯著降低，且存活率顯著下降，顯示該藻具抗捕食能力。(2)以鹵蟲餌料微藻球等鞭金藻(Isochrysis galbana)為對(duì)照，比較研究發(fā)現(xiàn)，相同的捕食壓力下，餌料金藻的葉綠素?zé)晒鈪?shù)(電子傳遞速率ETR和最大量子產(chǎn)率Fv/Fm)顯著降低，但顆石藻P.carterae的ETR和Fv/Fm沒有顯著變化，顯示顆石藻P.carterae對(duì)鹵蟲抗捕食作用。(3)相對(duì)于沒有捕食壓力的對(duì)照組，捕食壓力下，餌料金藻I.galbana的脂類組成沒有顯著差異。但是，顆石藻P.carterae的脂類組成則發(fā)生了顯著變化，主要表現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞葉綠體有重要作用的單半乳糖甘油二酯(MGDG)，雙半乳糖甘油二酯(DGDG)，磷脂酰甘油二酯(PG)含量上升，與促細(xì)胞分裂相關(guān)的二酰甘油(DAG)和磷脂酰肌醇(PI)也上升。這些脂類代謝物的變化可能在其種群水平上抵抗捕食并實(shí)現(xiàn)種群增殖中發(fā)揮作用。(4)培養(yǎng)介質(zhì)中磷的狀態(tài)對(duì)顆石藻P.carterae細(xì)胞二甲基巰基丙酸(Dimethyl sulfonio propionate，DMSP)含量有顯著影響，且影響顆石藻P.carterae對(duì)鹵蟲的致害效應(yīng):缺磷條件下生長(zhǎng)的顆石藻P.carterae首先使鹵蟲受害。當(dāng)培養(yǎng)液中僅以ATP為磷源時(shí)，顆石藻P.carterae的鹵蟲致害效應(yīng)則降低。研究證明，顆石藻P.carterae具有抗捕食能力，細(xì)胞的脂類代謝物質(zhì)以及DMSP可能在抗捕食防御中發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞:顆石藻P.carterae;抗捕食防御;鹵蟲;脂組;葉綠素?zé)晒鈪?shù); DMSP

文欣，劉寶寧，周成旭，蔣瑩，陳航霞.顆石藻Pleurochrysis carterae抗捕食特征.生態(tài)學(xué)報(bào)，2016，36(2): 525-534.

Wen X，Liu B N，Zhou C X，Jiang Y，Chen H X.Characterization of anti-predator abilities of Pleurochrysis carterae.Acta Ecologica Sinica，2016，36(2): 525-534.

顆石藻(Coccolithophores)是一類單細(xì)胞的光合自養(yǎng)鈣化微藻，屬定鞭藻，是現(xiàn)代海洋中繼硅藻和甲藻之后生物量最大的浮游植物，成為海洋初級(jí)生產(chǎn)力的重要組成部分。廣泛分布于沿海、大洋甚至內(nèi)陸咸水區(qū)域，可形成大面積高密度水華［1］。其細(xì)胞外被CaCO3晶體構(gòu)成了深海碳酸鹽重要來源［2］，在海洋生態(tài)環(huán)境、生物地化循環(huán)、生物地層學(xué)和古海洋學(xué)等方面有重要意義［3］。

Pleurocrysis carterae是一類常發(fā)于沿海和圍塘養(yǎng)殖環(huán)境的一種顆石藻，易快速增殖至高度密集狀態(tài)，可形成浮沫狀惡性水質(zhì)。實(shí)驗(yàn)研究表明，P.carterae是顯著引起鹵蟲死亡的顆石藻種類之一［4-6］。

隨著研究技術(shù)進(jìn)步，浮游植物的抗捕食防御現(xiàn)象及其機(jī)制研究得以深入開展［7］。捕食是微藻種群增殖的主要壓力之一，為了抵抗捕食或調(diào)整因捕食而造成的種群數(shù)量減少，微藻進(jìn)化出多種防御捕食策略。例如，被捕食時(shí)，微藻主動(dòng)聚群形成多細(xì)胞鏈或藻落，以物理方式增加捕食者的捕食難度［8］;微藻還可迅速啟動(dòng)針對(duì)捕食者的傷激防御機(jī)制［9］、產(chǎn)生毒素致死捕食者［10］、產(chǎn)生化學(xué)他感物質(zhì)使捕食者轉(zhuǎn)移捕食方向等［11］;微藻也可以通過提高大量增殖能力以應(yīng)對(duì)捕食壓力下種群數(shù)量的減少［12］。

顆石藻P.carterae種群增殖過程中都處于游動(dòng)單細(xì)胞，且捕食壓力存在時(shí)不發(fā)生物理聚集。研究表明，顆石粒(coccolith)并不是其致死鹵蟲或防御捕食的原因［4-5］。Moheimani等認(rèn)為，人工培養(yǎng)顆石藻P.carterae時(shí)不易受原生動(dòng)物捕食，很大程度上可能源于其產(chǎn)生的抗捕食防御物質(zhì)［13〗［14-15］。顆石藻P.carterae屬DMSP高產(chǎn)種類，我們?cè)缙谘芯恳诧@示，DMSP可能在顆石藻P.carterae致害鹵蟲中發(fā)揮作用［16］。但是，由于DMSP在微藻中意義多種多樣，且發(fā)揮作用時(shí)與群落組成、環(huán)境條件、生化代謝過程等多種因素相關(guān)［17］，這個(gè)領(lǐng)域尚需大量研究。

研究微藻抗捕食機(jī)制，最理想的是建立捕食者與被捕食者模式系統(tǒng)。鹵蟲(Artemia salina)是一個(gè)理想的模式生物，易于獲取及保存，方便培養(yǎng)，個(gè)體小且捕食能力強(qiáng)，常被用于毒理學(xué)研究及作為捕食者進(jìn)行生物種間關(guān)系的研究［18］。培養(yǎng)鹵蟲用的微藻多種多樣，其中球等鞭金藻(Isochrysis galbana)是一種鹵蟲適宜餌料，與顆石藻同屬于定鞭藻，但兩者對(duì)鹵蟲而言顯然差異顯著。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化是迅速表征微藻受到脅迫的重要參數(shù)［19］。脂類代謝與微藻重要的生物化學(xué)過程密切相關(guān)，特別是微藻質(zhì)膜糖脂可能在微藻抗捕食防御中發(fā)揮作用［20-21］。

為了研究顆石藻P.carterae抗捕食防御能力、特征及其機(jī)制，本文以鹵蟲為捕食者，以鹵蟲餌料金藻I.galbana為對(duì)照微藻，分析了顆石藻P.carterae對(duì)鹵蟲捕食能力的影響、捕食壓力下微藻的葉綠素?zé)晒庖约爸M響應(yīng)特征變化。由于磷對(duì)顆石藻的生理及其脂類生化代謝有重要影響［22］，本文還研究了磷元素影響下，指標(biāo)物質(zhì)DMSP的變化以及是否因此對(duì)鹵蟲存活能力產(chǎn)生影響。

1材料與方法

1.1藻種培養(yǎng)與鹵蟲孵化

顆石藻(P.carterae，NMBjih026)、球等鞭金藻(I.galbana，NMBjih-021-2)均來自寧波大學(xué)微藻種質(zhì)庫(kù)。實(shí)驗(yàn)前用f/2培養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)在溫度20℃、光強(qiáng)2200 lx(D∶L=12 h∶12 h)培養(yǎng)室中。

鹵蟲卵為本實(shí)驗(yàn)室4℃冰箱中低溫保存種(＜1a)，孵化前將鹵蟲卵置于常溫下2 h。在盛有150 mL過濾海水的燒杯中進(jìn)行孵化。溫度30℃，鹽度25‰，pH為8.0±0.2，光照孵化。

1.2顆石藻P.carterae對(duì)鹵蟲攝食率的影響

實(shí)驗(yàn)在6孔組織培養(yǎng)板上進(jìn)行。所用鹵蟲為餌料金藻喂養(yǎng)的15日齡成蟲。實(shí)驗(yàn)前將鹵蟲置于消毒海水中饑餓處理24h，用消毒海水清洗3次以清除體外附著的微藻。

實(shí)驗(yàn)組設(shè)置每孔分別加入10 mL以不同細(xì)胞數(shù)比例混合的金藻(I)和顆石藻P.carterae(P)藻液，顆石藻P.carterae的比例逐漸增加(I/P比例分別為10∶0，8∶2，5∶5，2∶8，0∶10)，混合總藻細(xì)胞密度約1×105個(gè)/mL。每孔加入5只大小相同的活躍成蟲。以消毒海水作為饑餓對(duì)照。各3個(gè)平行。所有培養(yǎng)板均置于溫度22℃，光照2200—3000 lx(D∶L=12 h∶12 h)的培養(yǎng)條件下。

取樣時(shí)間組設(shè)置和檢測(cè)方法按照上述實(shí)驗(yàn)組，相同設(shè)置5、24 h取樣時(shí)間組。實(shí)驗(yàn)開始后，對(duì)各時(shí)間點(diǎn)各實(shí)驗(yàn)組，觀察鹵蟲的活動(dòng)敏捷度，記錄鹵蟲的存活數(shù)，取出全部鹵蟲，于消毒海水中清洗3次以去除體表藻液。迅速冷凍備測(cè)腸道中的葉綠素。

鹵蟲存活率

式中，Rt為t時(shí)間點(diǎn)的鹵蟲存活率，Nt為t時(shí)間點(diǎn)的存活鹵蟲數(shù)。

鹵蟲捕食率測(cè)定通過測(cè)定葉綠素a的含量來表示鹵蟲腸道中藻細(xì)胞色素含量，表征其捕食能力的大小。葉綠素測(cè)定基于Arnon的方法［23］，將鹵蟲樣品避光解凍，置于玻璃離心管中，定量添加90％丙酮，并以移液器頭搗碎蟲體，移液器頭保留在玻璃管中，4℃避光密閉萃取24h。離心取上清液，以90％丙酮為空白，于酶標(biāo)儀上分別檢測(cè)630 nm和663 nm處的吸光值(OD630和OD663)。以下列公式計(jì)算葉綠素含量，n各實(shí)驗(yàn)組表示鹵蟲的總只數(shù)。

采用單因素方差分析方法進(jìn)行差異顯著性分析。

1.3捕食壓力對(duì)顆石藻P.carterae生理生化的影響

1.3.1捕食壓力下，顆石藻P.carterae的葉綠素?zé)晒鈪?shù)ETR和Fv/Fm的變化

實(shí)驗(yàn)在250 mL錐形瓶中進(jìn)行。藻液體積200 mL，密度約1×105個(gè)/mL的顆石藻P.carterae或餌料等鞭金藻指數(shù)期藻液。藻液中投入10只鹵蟲成蟲，另以不加鹵蟲的顆石藻P.carterae和餌料等鞭金藻為非捕食對(duì)照組。各組3平行。所有錐形瓶均置于22℃、2200 lx、全光照培養(yǎng)條件下。分別在實(shí)驗(yàn)起始和24 h后，用葉綠素?zé)晒鈨x(Water-PAM)檢測(cè)各組葉綠素?zé)晒鈪?shù)ETR和Fv/Fm。各組測(cè)樣4次，取平均值。

1.3.2捕食壓力下，顆石藻P.carterae的脂組變化

實(shí)驗(yàn)組所用藻液體積為4000 mL，指數(shù)后期顆石藻P.carterea和餌料金藻，密度分別為3×105個(gè)/mL和1.8 ×106個(gè)/mL。所有錐形瓶均置于22℃、2200 lx、全光照培養(yǎng)條件下。分別設(shè)置加鹵蟲捕食組(鹵蟲3日齡，終密度1只/mL)以及不加鹵蟲的非捕食對(duì)照組。各3平行。分別在實(shí)驗(yàn)開始前和加入鹵蟲捕食24 h后收集各實(shí)驗(yàn)組藻液1000 mL，冰浴以停止其代謝過程，冷凍離心(5000 r/min，10 min，4℃)收集藻細(xì)胞制凍干藻粉備測(cè)。

總脂提取:分別稱取各實(shí)驗(yàn)組藻粉50 mg，每組3個(gè)平行，參考改進(jìn)后的Bligh-Dyer法［24］，用CHCl3∶CH3OH∶H2O(1∶2∶0.8)溶劑提取3次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空干燥，氮?dú)獯蹈?，甲醇?fù)溶，進(jìn)行LC-MS分析。LC-MS條件以及數(shù)據(jù)處理分析參考文獻(xiàn)［25］。

1.4磷對(duì)顆石藻P.carterae細(xì)胞中DMSP含量的影響及其與鹵蟲致死率的關(guān)系

提供不同的磷源以分析細(xì)胞DMSP含量差異，同時(shí)分析DMSP含量的差異是否造成P.carterae致害鹵蟲作用差異。

1.4.1磷源差異對(duì)顆石藻P.carterae細(xì)胞內(nèi)DMSP含量的影響

將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期的顆石藻P.carterae，接種到缺磷的f/2加富的人工海水［26］培養(yǎng)液中進(jìn)行1周的磷饑餓培養(yǎng)。鹽度28‰，pH 8.0±0.2。初始接種密度為4×105個(gè)/mL。磷饑餓培養(yǎng)后，取藻液離心(6000 r/min，10 min，4℃)收集藻細(xì)胞制凍干藻粉備測(cè)初始參數(shù)。將處于磷饑餓狀態(tài)的藻液分3組，其中一組以1∶1接種到缺磷的f/2培養(yǎng)液中，一組以1∶1接種到完整的以KH2PO4為磷源的f/2培養(yǎng)液中，一組以1∶1接種到完整的以ATP為磷源(相同P摩爾數(shù))的f/2培養(yǎng)液中。藻液總體積1000 mL，每組各3平行。培養(yǎng)條件為22℃，4000—5000 lx(D∶L=12 h∶12 h)。培養(yǎng)3d后，從每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中取藻液800 mL，相同離心除上清液，收集藻細(xì)胞制凍干藻粉備測(cè)。

取等量?jī)龈稍宸壑茦?，于核磁共振儀(Bruker AVⅢ400MHz譜儀，德國(guó)Bruker公司)檢測(cè)樣品DMSP含量。NMR定性定量檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析方法參考葉央芳(2011)［27］。DMSP的一維1HNMR譜圖分別在化學(xué)位移2.74、2.76、3.44、3.48以及4.77處可見氫原子的吸收峰，通過顆石藻P.carterae提取物的一維1H NMR譜對(duì)DMSP定性定量分析。

1.4.2磷源差異下培養(yǎng)的顆石藻P.carterae對(duì)鹵蟲致死率的影響

分別取上述處于不同磷態(tài)的實(shí)驗(yàn)組藻液，置于24孔組織培養(yǎng)板，必要時(shí)，以對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)組去藻濾液相應(yīng)稀釋，使各孔的藻細(xì)胞終密度為1×105個(gè)/mL，藻液總體積2 mL。各孔分別加入10尾3日齡鹵蟲幼蟲(以10 μL移液器每次吸取1尾)，以相同密度的餌料金藻為喂養(yǎng)對(duì)照，以消毒海水為饑餓對(duì)照。每組3個(gè)平行。分別于0、24、48、72 h在倒置顯微鏡下檢測(cè)鹵蟲死亡數(shù)。

2　結(jié)果

2.1顆石藻P.carterae對(duì)鹵蟲攝食率的影響

通過提取鹵蟲體內(nèi)葉綠素a含量表征其捕食情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，顆石藻P.carterae占比顯著影響鹵蟲攝食:雖然缺乏實(shí)驗(yàn)前鹵蟲體內(nèi)葉綠素狀態(tài)的數(shù)據(jù)，但是，除I/P 8∶2組外，5 h葉綠素a含量差異不顯著，均在0.35 mg/L以上。I/P 8∶2組最大，為0.46 mg/L。24 h，I/P 8∶2組葉綠素含量與5 h沒有顯著差異，可能也是因?yàn)樵摻M初始狀態(tài)體內(nèi)食物含量即較高緣故。但其他各組葉綠素含量均比5 h降低，且隨顆石藻P.carterae的占比增加而顯著下降。此時(shí)，鹵蟲存活率還維持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，如表1的結(jié)果顯示，5 h，實(shí)驗(yàn)組沒有出現(xiàn)鹵蟲死亡，鹵蟲活躍。24 h，有鹵蟲死亡現(xiàn)象，但鹵蟲存活率與顆石藻P.carterae占比增加尚未見顯著的梯度相關(guān)。因此，鹵蟲體內(nèi)葉綠素含量的降低是鹵蟲攝食能力降低的體現(xiàn)。說明顆石藻對(duì)鹵蟲的捕食能力產(chǎn)生了影響。

圖1　球等鞭金藻(I)和顆石藻P.carterae(P)不同混合比例(I/P)混合喂養(yǎng)的鹵蟲體內(nèi)葉綠素a含量Fig.1　Chlorophyll a content in Artemia salina feeding on cocultures of Isochrysis galbana(I)and Pleurochrysis carterea(P)mixed in different proportions(I/P)

2.2捕食壓力對(duì)顆石藻P.carterae生理生化的影響

2.2.1捕食壓力下，顆石藻P.carterae葉綠素?zé)晒鈪?shù)

ETR和Fv/Fm的變化

相同捕食壓力下，顆石藻P.carterae和餌料金藻的葉綠素?zé)晒鈪?shù)呈現(xiàn)不同變化特征(圖2)。捕食壓力作用24 h后，餌料金藻的最大量子產(chǎn)率Fv/Fm和電子傳遞速率ETR均顯著下降(P＜0.01)。但顆石藻P.carterae的Fv/Fm以及ETR均沒有顯著差異(P＞0.05)。

表1　不同球等鞭金藻(I)/和顆石藻P.carterae(P)混合比例(I/P)下的鹵蟲存活率Table 1 Survival rates of Artemia salina in co-cultures of Isochrysis galbana(I)and Pleurochrysis carterea(P)mixed in different proportions(I/P)

圖2　捕食或無捕食壓力下球等鞭金藻和顆石藻P.carterea的Fv/Fm和ETR變化Fig.2 Changes of Fv/Fm and ETR in Isochrysis galbana and Pleurochrysis carterae when cultured with or without predators

葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm和ETR反應(yīng)了兩種微藻受到捕食作用的差異，參數(shù)變化的特征顯示，餌料金藻受到了來自鹵蟲的顯著捕食脅迫，而鹵蟲對(duì)顆石藻P.carterae的捕食脅迫則顯著小。因此，葉綠素參數(shù)特征也顯示顆石藻P.carterae具有抗捕食能力。

2.2.2捕食壓力下，顆石藻P.carterae脂組代謝物變化

經(jīng)MarkerLynx處理，對(duì)微藻樣品在正、負(fù)離子模式下信號(hào)峰的相對(duì)信號(hào)總強(qiáng)度經(jīng)歸一化進(jìn)行PCA主成分分析。結(jié)果顯示，餌料金藻在捕食壓力存在與否的情況下，不同樣品組的分布趨勢(shì)沒有差異，說明餌料金藻在捕食壓力存在與否的情況下，其脂類組成沒有變化。而顆石藻P.carterae的捕食壓力樣品組與沒有捕食壓力的對(duì)照組的分布趨勢(shì)差異顯著(圖3)，說明顆石藻P.carterae在有捕食壓力時(shí)，其脂類代謝發(fā)生顯著變化(正負(fù)離子模式下R2分別為0.868和0.84)。

圖3　正負(fù)離子掃描模式，球等鞭金藻和顆石藻P.carterae在捕食壓力存在與否情況下脂組PCA得分圖Fig.3 PCA scores plot in positive and negative ion scan mode for Isochrysis galbana and Pleurochrysis carterae with or without predatorsA:球等鞭金藻的正離子模式，B:球等鞭金藻的負(fù)離子模式，C:顆石藻P.carterae正離子模式，D:顆石藻P.carterae的負(fù)離子模式，空心點(diǎn)表示捕食壓力組，實(shí)心點(diǎn)表示沒有捕食壓力的對(duì)照組

數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，相對(duì)于沒有捕食壓力對(duì)照組，捕食壓力下，顆石藻P.carterae發(fā)生顯著變化的脂類物質(zhì)主要為:單半乳糖甘油二酯(MGDG)、雙半乳糖甘油二酯(DGDG)、二酰甘油(DAG)、三酰甘油(TAG)、磷脂酰甘油(PG)、甜菜堿酯(DGCC，DGTS)，二酰甘油硫代糖脂(SQDG)、磷脂酰膽堿(PC)以及磷脂酰肌醇(PI)。表2顯示了捕食壓力下的顆石藻P.carterae細(xì)胞脂類相對(duì)于沒有捕食壓力的變化。結(jié)果顯示，細(xì)胞的葉綠體脂類發(fā)生變化，MGDG，DGDG，PG都呈現(xiàn)上升，而SQDG下降;與促細(xì)胞分裂密切相關(guān)的DAG和PI也上升。因捕食壓力造成的這些脂類含量差異，可能在顆石藻P.carterae抵抗捕食的生理代謝過程中有重要的意義。

表2　捕食壓力下顆石藻P.carterae細(xì)胞中發(fā)生顯著變化的脂類Table 2 Significant lipids changes in Pleurochrysis carterae under grazing pressure compared with control

2.3磷源差異對(duì)顆石藻P.carterae細(xì)胞二甲基巰基丙酸(DMSP)含量的影響及其與鹵蟲致死率的關(guān)系

2.3.1磷源差異對(duì)細(xì)胞二甲基巰基丙酸(DMSP)含量的影響

從表3可以看出，相對(duì)于初始狀態(tài)，缺磷條件下生長(zhǎng)使細(xì)胞DMSP的含量增加。完整的f/2培養(yǎng)液中，細(xì)胞的DMSP含量下降。但增加或下降后的兩組DMSP含量沒有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以ATP為唯一磷源時(shí)，細(xì)胞DMSP下降顯著(P＜0.05)。結(jié)果顯示，細(xì)胞的DMSP代謝與培養(yǎng)介質(zhì)中磷態(tài)相關(guān)，能源物質(zhì)ATP可能在DMSP代謝中發(fā)揮作用。

表3　不同磷態(tài)對(duì)顆石藻P.carterae細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞二甲基巰基丙酸(DMSP)含量的影響/(mg/g)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)Table 3 Cellular content(Mean±SD，mg/g)of DMSP in Pleurochrysis carterae cultured in the mediums with different phosphorus states

2.3.2磷源差異與鹵蟲致死率的相關(guān)性

不同磷源差異培養(yǎng)液中的顆石藻P.carterae對(duì)鹵蟲的致死結(jié)果顯示:各組藻液均對(duì)鹵蟲產(chǎn)生致死效應(yīng)(圖4)。顆石藻P.carterae對(duì)鹵蟲無急性毒性，24 h內(nèi)的致死效果不明顯。但是，缺磷組DMSP含量相對(duì)高，在24 h首先顯示鹵蟲致害。以ATP為磷源的實(shí)驗(yàn)組DMSP含量最低，其鹵蟲致死率在48 h和72 h的檢查中始終為所有實(shí)驗(yàn)組中最低。由于缺磷組DMSP與完整f/2培養(yǎng)液中細(xì)胞DMSP含量差異不顯著，可能導(dǎo)致這兩組的鹵蟲致死率差異不顯著(P＞0.05)。

圖4　磷差異狀態(tài)造成顆石藻對(duì)鹵蟲的致死效應(yīng)變化Fig.4　Mortalities of Artemia salina in cultures of Pleurochrysis carterae cultured in mediums with different phosphorus states

3　討論

作為食物鏈中的初級(jí)生產(chǎn)者，高防御捕食能力的微藻具有更強(qiáng)的種群增殖能力。目前研究顯示，微藻抗捕食的機(jī)制主要表現(xiàn)為形態(tài)學(xué)防御、化學(xué)防御和行為防御［28］。例如，硅藻的硅殼可能是長(zhǎng)期進(jìn)化過程中有利于抵抗捕食的一種結(jié)構(gòu)［29］。Pondaven等的研究表明，威氏海鏈藻Thalassiosira weissflogii受到捕食壓力時(shí)，細(xì)胞硅化程度會(huì)提高［30］。但是，通常認(rèn)為，顆石藻P.carterae的鈣殼并不具有抵抗捕食的作用，并且也不是顆石藻P.carterae致害鹵蟲的原因。Houdan等的也研究顯示，Pleurochrysis屬的幾種顆石藻對(duì)鹵蟲的作用是不同的，顆石藻P.carterae具有顯著的致死作用，而同屬的P.dentata以及同樣具有鈣殼的Hymenomonadaceae科的幾種顆石藻則沒有致害作用［4］。

具有化學(xué)防御能力的微藻，通過向水中分泌捕食排斥物［31］或藻毒素［32-33］，使捕食者回避捕食或捕食后致害而實(shí)現(xiàn)抗捕食防御功能。例如，劇毒卡羅藻Karlodinium veneficum分泌的系列卡羅藻毒素(KmTx)，可以使原生動(dòng)物捕食者改變方向或致害捕食者［32］。Strom等研究發(fā)現(xiàn)，在顆石藻Emiliania huxleyi與隱藻Rhodomonas salina不同體積混合的藻液中，異養(yǎng)甲藻Amphidinium longum會(huì)優(yōu)先攝食隱藻，從而使顆石藻E.huxleyi可以在競(jìng)爭(zhēng)中勝出［34］。

DMSP是一種被廣泛研究的水生生物化學(xué)防御物質(zhì)?，F(xiàn)代海洋中，生物量巨大且易形成赤潮的甲藻和定鞭藻都是DMSP高產(chǎn)類群。對(duì)不同級(jí)的捕食者而言，水生環(huán)境中的DMSP的作用有兩種:誘導(dǎo)捕食和抵抗捕食。植食性原生動(dòng)物可能回避DMSP及其裂解酶含量高的微藻，實(shí)現(xiàn)這類微藻的抗捕食化學(xué)防御目標(biāo)［35］。DMSP通過機(jī)械或生化作用裂解產(chǎn)生揮發(fā)性DMS，又是誘導(dǎo)更高一級(jí)捕食者的信號(hào)物質(zhì)［36］。

本文研究顯示，隨著顆石藻P.carterae在餌料金藻中的比例增加，鹵蟲的攝食率明顯下降;有鹵蟲的捕食實(shí)驗(yàn)組中，顆石藻P.carterae的葉綠素?zé)晒鈪?shù)沒有顯著變化，證明其受到的捕食壓力小，均說明顆石藻P.carterae有抵抗鹵蟲攝食能力。目前尚未在顆石藻中發(fā)現(xiàn)任何毒素，但普遍認(rèn)為，細(xì)胞DMSP及其裂解產(chǎn)物DMS和丙烯酸在顆石藻與生物及非生物環(huán)境關(guān)系中發(fā)揮著重要作用［36］。同時(shí)，DMSP裂解酶及其活性在其間扮演重要角色。本研究結(jié)果顯示，不同磷態(tài)培養(yǎng)液會(huì)使顆石藻P.carterae細(xì)胞內(nèi)的DMSP含量發(fā)生變化，各培養(yǎng)條件下的顆石藻P.carterae細(xì)胞對(duì)鹵蟲的致害也有差異。缺磷組首先導(dǎo)致鹵蟲死亡;外源ATP培養(yǎng)條件下，對(duì)鹵蟲的致死率則降低。DMSP在藻細(xì)胞被消化時(shí)才產(chǎn)生DMS，同時(shí)產(chǎn)生的丙烯酸可能是致害原因［36］。實(shí)驗(yàn)鏡檢發(fā)現(xiàn)，鹵蟲腸道中有明顯顆石藻P.carterae細(xì)胞。鹵蟲屬濾食性，在餌料金藻與顆石藻P.carterae混合液中，可能無法選擇或排斥顆石藻P.carterae細(xì)胞，從而導(dǎo)致受害。并且，不同DMSP裂解酶活性差異可能是產(chǎn)生鹵蟲致害的關(guān)鍵因素。有研究顯示，氮限制對(duì)顆石藻E.huxleyi的細(xì)胞內(nèi)DMSP含量沒有影響［37-38］，但是，氮限制可提高DMSP裂解酶的活性，從而使氮限制條件下DMS的產(chǎn)量增加［38］。磷營(yíng)養(yǎng)水平及化合物狀態(tài)是否影響顆石藻P.carterae的DMSP裂解酶活性有待研究。DMSP裂解酶活性高的種類可能產(chǎn)生更高的致害產(chǎn)物。這樣或許可以解釋Houdan實(shí)驗(yàn)里不同種類的Pleurochrysis屬的顆石藻不同的致害強(qiáng)度，以及在不同的生長(zhǎng)周期，同種顆石藻對(duì)鹵蟲的致害差異。顆石藻是低營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中具有高競(jìng)爭(zhēng)能力的微藻［39］，在營(yíng)養(yǎng)鹽限制條件下，其DMSP裂解酶及其活性提高的特性，可能使其抵抗捕食能力提高，從而增加其種群競(jìng)爭(zhēng)能力，實(shí)現(xiàn)增殖優(yōu)勢(shì)。

捕食脅迫下，浮游植物啟動(dòng)的抗捕食防御機(jī)制都是在復(fù)雜的代謝調(diào)節(jié)下實(shí)現(xiàn)的［28］。例如，硅藻除了以硅殼結(jié)構(gòu)的物理性質(zhì)抵抗捕食之外，還具有受捕食壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞硅化調(diào)節(jié)響應(yīng)過程［30］。Zwirglmaier等［40］發(fā)現(xiàn)，聚球藻Synechococcus不同株細(xì)胞表面脂多糖的差異，形成了各株對(duì)捕食者的抗捕食能力差異。Parris等認(rèn)為，微藻糖脂很可能是甲藻生態(tài)毒性的一個(gè)重要原因［20］。Cutignano等發(fā)現(xiàn)，海鏈藻Thalassiosira rotula的葉綠體膜上的糖脂是在浮游動(dòng)物攝食過程中產(chǎn)生化學(xué)防御物質(zhì)不飽和脂肪醛的來源［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，顆石藻P.carterae脂類結(jié)構(gòu)組顯示其具有典型定鞭藻門(Haptophyta)的特點(diǎn)，即具有DGCC，這個(gè)類別的脂類在微藻中不常見，一般認(rèn)為是進(jìn)化上后期出現(xiàn)的脂類［41］。受到捕食壓力和未受到捕食壓力的顆石藻P.carterae比較，總脂組成有顯著差異。其中細(xì)胞的葉綠體脂類MGDG，DGDG，PG都呈現(xiàn)上升，而只有SQDG下降，但一般認(rèn)為MGDG和DGDG往往在葉綠體中更加重要［42-43］。PI往往是細(xì)胞儲(chǔ)能水平的一個(gè)前提物質(zhì)，通過PI繼續(xù)磷酸化過程，細(xì)胞內(nèi)可以儲(chǔ)存更多的能量，肌醇磷酸的能量?jī)?chǔ)存比ATP更高［44］。DAG則反過來，往往是PI被裂解后產(chǎn)生的二次信使物質(zhì)，往往是促進(jìn)細(xì)胞分裂的信號(hào)［45］。顆石藻在受到捕食壓力時(shí)，其脂組發(fā)生顯著變化的這些特征，可能在其抵抗捕食以及致害捕食者的過程中發(fā)揮作用。顆石藻種群在經(jīng)過捕食壓力后，光合作用能力可能會(huì)上升，種群增殖能力可能會(huì)提高。但需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

總之，本研究結(jié)果顯示，利用鹵蟲與顆石藻P.carterae構(gòu)成的捕食者與被捕食者體系中，顆石藻P.carterae使鹵蟲的攝食率顯著降低、微藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)無顯著變化，均顯示顆石藻P.carterae具有抵抗鹵蟲捕食特征。捕食壓力下，顆石藻P.carterae的脂組代謝發(fā)生顯著變化，可能在其抵抗捕食的生化調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。磷元素的生化代謝過程可能影響DMSP及其裂解酶的代謝調(diào)節(jié)，從而造成顆石藻P.carterae對(duì)鹵蟲致害的差異。具有高生物量廣泛分布的顆石藻P.carterae，可能通過高效且多樣的生理生化調(diào)節(jié)能力，達(dá)到抵御捕食壓力的目標(biāo)，實(shí)現(xiàn)種群增殖優(yōu)勢(shì)。

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Characterization of anti-predator abilities of Pleurochrysis carterae

WEN Xin，LIU Baoning，ZHOU Chengxu*，JIANG Ying，CHEN Hangxia
School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211，China

Abstract:The coccolithophorid species Pleurochrysis carterae is a common coastal calcifying phytoplankton，which is also able to form dense blooms that harm marine aquaculture.The anti-predator ability of P.carterae is supposed to be one reason why it is a dominant species.In this study，this hypothesis is tested by using brine shrimp Artemia salina as the model predator.Another Prymnesiophyceae species，Isochrysis galbana，which is considered as the benign live food source for A.salina，was used as prey.Changes to the grazing rate or survival rate of A.salina were analyzed when P.carterae was present in the prey mixture.Algal chlorophyll fluorescence efficiency and lipid changes in these two algal species under predation pressure were also studied.Some very interesting P.carterae features were observed，which may provide insights into its anti-predator abilities.These were as follows:(1)When the P.carterae cell numbers increases in the microalgal prey mixture，the brine shrimp A.salina has a lower predation capacity，which is shown by the gradient decrease of chlorophyll content in the brine shrimp intestines.The survival rate is also lower as the number of P.carterae cells increase.book=601,ebook=329Therefore，these results clearly indicated the anti-predator ability of P.carterae.(2)In comparison，the chlorophyll fluorescence(ETR and Fv/Fm)for the two microalgae facing the same predation pressure decreased significantly from 0.75 to 0.60 for Fv/Fm，and from 88％ to 65％ for ETR，respectively，for I.galbana，but were almost unchanged for P.carterae.This means that photosynthesis of P.carterae is virtually unaffected by the presence of the predator.Such unconstrained ability against the predator was very prominent.(3)Lipidomic analyses，with without the predator，between the two microalgal species indicated that I.galbana did not show any significant changes，whereas P.carterae did significant increase its monogalactosyl diacylglycerol(MGDG)，digalactosyldiacylglycerol(DGDG)，phosphatidylglycerol(PG)，diacylglycerol(DAG)，and phosphatidylinositol(PI)contents.Since MGDG，DGDG，and PG are the major components of the chloroplast membrane，the increase in these compounds can have protective effects on the microalgal cell，and both DAG and PI are considered important signals for cell division，so their increase can stimulate the population growth.Hence，the lipid changes clearly provide the biochemical evidence for the physiologically positive changes to P.carterae，in the presence of the predator.(4)Dimethyl sulfoniopro pionate(DMSP)is supposed to contribute in the anti-predator abilities of microalgae.We further studied whether the mortality of A.salina was affected by the algal cellular DMSP content.Cultures containing different cellular DMSP contents were set up by adjusting the phosphorus chemical states in the f/2 culture medium，namely phosphate deficiency，normal f/2，and f/2 medium with ATP as the phosphate supplier.The results showed that，the ambient phosphorus chemical states significantly affect the intracellular DMSP level in P.carterae.After three days of exponential growth，the phosphate deficiency group increased DMSP from 2.35 to 2.42 mg/g lyophilized cells，whereas the normal f/2 medium group reduced DMSP from 2.35 to 2.26 mg/g lyophilized cells，and the ATP enriched group showed the largest decrease in DMSP from 2.35 to 1.90 mg/g lyophilized cells.This indicated that the phosphorus level and chemical state had negative effects on the accumulation of DMSP.Furthermore，，the phosphorus state can affect the preying behavior and mortality of A.salina.Phosphorus deficiency in the culture medium can increase the algal cell's fatal effects on the predator，while ATP，as the sole phosphorus source，may decrease the fatal effects.

We conclude that P.carterae contains positive biochemical mechanisms that underlie its anti-predator abilities，possibly through cell membrane component protective reconstruction and DMSP metabolism.Its active anti-preying abilities mean that P.carterae can reach a sustainable population size at the ecological level.

Key Words:Pleurochrysis carterae; anti-predator; Artemia salina; lipidomic; chlorophyll fluorescence; DMSP

*通訊作者

Corresponding author.E-mail: zhouchengxu@ nbu.edu.cn

收稿日期:2014-01-17;網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2015-06-10

基金項(xiàng)目:浙江省自然科學(xué)基金(LY12D06001);教育部博士點(diǎn)優(yōu)先發(fā)展領(lǐng)域課題(20133305130001);浙江省重大科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(2011R10029);浙江省重點(diǎn)基金(Z3100565)

DOI:10.5846/stxb201401170133