王　征，劉建利，唐志書*，宋忠興

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點實驗室

陜西省風(fēng)濕與腫瘤類中藥制劑工程技術(shù)研究中心，陜西 咸陽 712083；

2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 西部資源與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點實驗室，西安 710069)

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千年健寒熱藥性的實驗評價

王征1，劉建利2，唐志書1*，宋忠興1

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點實驗室

陜西省風(fēng)濕與腫瘤類中藥制劑工程技術(shù)研究中心，陜西 咸陽 712083；

2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 西部資源與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點實驗室，西安 710069)

摘要：目的通過前期建立的中藥寒熱藥性的細胞評價方法評價中藥千年健的寒熱藥性。方法用噻唑藍(MTT)比色法考察千年健對SGC-7901細胞體外增殖的影響，倒置顯微鏡觀察千年健對細胞形態(tài)特征的影響，臺盼藍染色法分析千年健的細胞毒作用。結(jié)果千年健在5 μg/mL(含5 μg/mL)以下對細胞生長有促進作用。形態(tài)學(xué)觀察表明千年健在5 μg/mL(含5 μg/mL)以下使細胞密度增加，細胞結(jié)構(gòu)致密、生長旺盛。臺盼藍染色表明千年健對這2種細胞沒有細胞毒作用。結(jié)論千年健藥性應(yīng)為溫?zé)?，且對所用細胞沒有細胞毒作用。

關(guān)鍵詞：千年健；寒熱藥性；MTT法；SGC-7901細胞；臺盼藍染色

千年健始載于《本草綱目拾遺卷五》，為天南星科多年生草本植物千年健Homalomenaocculta(Lour.)Schott的根莖[1]?！侗静菰傩隆费云湮犊?，性寒。《中藥學(xué)》認為其味苦，性溫[2]。上述文獻表明對千年健寒熱藥性的認識存在分歧，為了對其寒熱屬性有一個客觀的認識，有必要進行實驗研究。本實驗室在前期的工作中，基于細胞模型建立了評價中藥寒熱藥性的方法[3-5]。該方法基于溫?zé)崴幙梢允股矬w的生理功能亢奮，而寒涼藥則使得生物體生理功能表現(xiàn)為抑制[6]。用動物模型也可得出同樣的結(jié)論，即用寒藥造模可以使動物的體溫降低，中樞興奮抑制以及代謝減慢，而熱藥的作用則相反[7-8]。由此可以推測，寒熱藥對生物體最小的組成單位細胞也應(yīng)該有一定的影響，即寒藥會抑制細胞的生長增殖,而熱藥則會表現(xiàn)出促進作用。在前期的工作中已經(jīng)驗證了這一想法，已用本法對野菊花、白頭翁、丹參及白薇等寒熱藥性文獻記載不一的中藥藥性進行了實驗評價。本文用MTT法對寒熱藥性進行評價，MTT進入活細胞后被線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為藍紫色的甲臜(Formazan)結(jié)晶并在細胞中沉積。結(jié)晶可以被二甲基亞砜(DMSO)溶解，并在490 nm波長處具有最大吸收，以此間接反映活細胞數(shù)量[9]。臺盼藍染色(Trypan Blue)是檢測細胞膜完整性最常用的方法。由于細胞死亡后細胞膜的完整性喪失，通透性增加，因此細胞可以被臺盼藍染成藍色，而活細胞由于細胞膜的存在而使得臺盼藍難于進入細胞內(nèi)。經(jīng)染色后的細胞可以通過顯微鏡觀察，經(jīng)細胞計數(shù)對細胞存活率進行比較精確地分析。

1材料

1.1細胞株人胃癌細胞株SGC-7901，由第四軍醫(yī)大學(xué)提供。1.2實驗儀器μQuant 酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek)、CO2培養(yǎng)箱(Sanyo公司)、細胞96孔培養(yǎng)板、普通倒置光學(xué)顯微鏡、超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。

1.3藥品與試劑千年健(購自西安藻露堂醫(yī)藥超市,經(jīng)西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院房敏峰高級工程師鑒定為正品藥材)、HyClone改良型RPMI-1640培養(yǎng)液(賽默飛世爾生物化學(xué)制品北京有限公司)、四季青無支原體胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、MTT、二甲基亞砜(DMSO)、PBS(磷酸緩沖液)、0.25%胰蛋白酶(西安舟鼎國生物技術(shù)有限公司)、臺盼藍染料(西安沃爾森生物技術(shù)有限公司)。

2方法

2.1受試藥品溶液的制備稱取千年健20 g,煎煮3次,30 min/次,合并煎液,濃縮,定容至20 mL,質(zhì)量濃度為1 g/mL。藥液10 000 r/min,離心30 min,上清液用0.22 μm的微孔濾膜濾過,無菌水稀釋至10 mg/mL,備用。

2.2細胞培養(yǎng)將SGC-7901細胞在含有10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(pH 7.0～7.4)、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中、5%CO2及飽和濕度條件下進行傳代培養(yǎng)。

2.3MTT試驗取對數(shù)生長期、密度為5×107/L的SGC-7901細胞接種于含200 μL RPMI-1640培養(yǎng)基的96孔板上,置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,待細胞貼壁后更換新鮮培養(yǎng)液(200 μL/孔),實驗組設(shè)8個濃度梯度，分別為2、5、10、20、50、100、200、400 μg/mL，每個濃度設(shè)3個重復(fù)孔。加藥完畢后96 孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后更換培養(yǎng)基(180 μL/孔),然后加入新鮮配制的MTT溶液(5 g/L)20 μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸棄上清液,每孔加入150 μL DMSO,在37 ℃恒溫搖床上震蕩10 min(60次/min)后，測定490 nm處吸光度(A)值。按下列公式計算細胞抑制率[10]，實驗重復(fù)3 次。

2.4臺盼藍染色參照2.3中步驟將對數(shù)生長期細胞用0.25%的胰蛋白酶消化后接種于96孔板培養(yǎng)48 h后，更換新鮮培養(yǎng)基,每孔加入20 μL、0.4%的臺盼藍染液,作用5 min后在普通光鏡下觀察。

3結(jié)果

3.1MTT法檢測用MTT法分別檢測千年健在2～400 μg/mL濃度范圍內(nèi)SGC-7901細胞體外增殖的影響見表1。

表1　 千年健對SGC-7901細胞體外增殖的影響

注：與對照組比較，#P<0.05，## P<0.01

從表1可以看出，千年健濃度為2、5 μg/mL時，可以促進SGC-7901細胞的增殖。在2 μg/mL濃度下促進作用顯著，抑制率為17.52%，而隨著濃度的增大促進作用逐漸減弱，在5 μg/mL濃度下幾乎對細胞的生長增殖不起作用。而當(dāng)濃度大于5 μg/mL時則對SGC-7901細胞的生長增殖表現(xiàn)出抑制作用。為了能更加直觀的看出千年健對SGC-7901細胞的抑制率隨濃度變化的趨勢，以抑制率對濃度作圖，所得曲線見圖1。

圖1　千年健對SGC-7901細胞增殖抑制率變化

從圖1中可以直觀的看到千年健對SGC-7901細胞增殖的作用隨濃度從低到高而表現(xiàn)為先促進后抑制，抑制作用與濃度的增大有關(guān)，并且隨著濃度的進一步增大，抑制作用還會加強。根據(jù)筆者以前所得實驗結(jié)果判斷，千年健性溫?zé)?。此與《中藥學(xué)》所述一致，并為《中藥學(xué)》所述提供了有力的實驗證據(jù)支撐。

3.2千年健對SGC-7901細胞形態(tài)的影響觀察對照組與加藥組在倒置顯微鏡下的觀察拍照的照片。

選取2、400 μg/mL濃度下的細胞照片與空白對照組照片比較?？梢郧宄目吹脚c空白對照組相比較，2 μg/mL濃度下的細胞密度增加，而400 μg/mL濃度下細胞密度明顯降低，細胞形態(tài)也發(fā)生變化。正常的SGC-7901細胞呈不規(guī)則的多邊形，細胞核膜、核仁輪廓明顯，細胞延展且扁平。在2 μg/mL濃度下細胞形態(tài)良好，結(jié)構(gòu)致密，生長旺盛。而400 μg/mL處細胞密度明顯下降，細胞變圓，細胞顆粒感增加。

3.3臺盼藍染色SGC-7901細胞經(jīng)臺盼藍染色后均未見有著色細胞，說明千年健在本實驗所選濃度范

圍內(nèi)對SGC-7901細胞沒有細胞毒作用。

4結(jié)論

千年健作為一種傳統(tǒng)的中藥，歷來對其寒熱藥性說法不一?！侗静菰傩隆费云湮犊?，性寒，而《中藥學(xué)》認為其性溫。寒熱藥性多是歷代醫(yī)家根據(jù)自己的用藥經(jīng)驗總結(jié)而來，長期以來缺少一個科學(xué)的評價寒熱藥性的實驗方法，因而無法形成統(tǒng)一的認識。依據(jù)所建立的評價中藥寒熱藥性的方法，通過MTT法檢測了千年健對SGC-7901細胞體外增殖的影響，在低濃度下千年健對SGC-7901細胞的增殖表現(xiàn)為促進作用，而當(dāng)濃度大于5 μg/mL時則表現(xiàn)出抑制作用。且經(jīng)過臺盼藍染色觀察到千年健對SGC-7901細胞不產(chǎn)生細胞毒性。根據(jù)熱藥可能會促進細胞生長、增殖，而寒藥會表現(xiàn)為抑制，可以得出千年健性溫?zé)徇@一科學(xué)的結(jié)論。這與《中藥學(xué)》所載一致，并且為《中藥學(xué)》的觀點提供了科學(xué)的實驗證據(jù)支撐。

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Evaluating cold and hot characteristic ofHomalomenaocculta(Lour.) Schott by experimental method

WANG Zheng1,LIU,Jianli2,TANG Zhishu1*,SONG Zhongxing1

(1.Shaanxi Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization,Shaanxi province key laboratory of new drugs and Chinese medicine foundation research,Shaanxi rheumatism and tumor center of TCM engineering technology research,Shaanxi University of Chinese Medicine,Xianyang 712083,China;2.Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China,Ministry of Education,College of Life Science,Northwest University,Xi’an 710069,China)

Abstract:ObjectiveEvaluate the cold and hot characteristic of Homalomena occulta (Lour.) Schott by cellular models.MethodsMTT assay was used to investigate the effect of Homalomena occulta (Lour.) Schott on the growth of SGC-7901 in vitro.Morphological changes of SGC-7901 treated with Homalomena occulta (Lour.) Schott were observed through invert microscope.Trypan-blue staining was used to analyze the cytotoxicity of Homalomena occulta (Lour.) Schott.ResultsHomalomena occulta (Lour.) Schott can promote the growth and proliferation of SGC-7901 in the concentration range of 2-5 μg/mL.Morphological observation showed Homalomena occulta (Lour.) Schott could increase the density of SGC-7901 in the same concentration range.Trypan-blue staining showed Homalomena occulta (Lour.) Schott had no cytotoxicity on SGC-7901.ConclusionThe results reveal in this work that Homalomena occulta (Lour.) Schott shows a hot or warm characteristic and have no cytotoxicity.

Keywords：Homalomena occulta (Lour.) Schott;cold and hot characteristic;MTT assay;SGC-7901;trypan-blue staining

(收稿日期:2015-09-25)

文章編號：2095-6258(2016)02-0266-03

中圖分類號：R285.1

文獻標(biāo)志碼：A

*通信作者：唐志書，教授，電子信箱-tzs6565@163.com

作者簡介：王征(1980-)，男，中藥學(xué)博士，講師，主要從事中藥活性成分的仿生合成與結(jié)構(gòu)修飾研究。

基金項目：國家自然科學(xué)基金(20872118);教育部博士點基金(20070697012);陜西省重點科技創(chuàng)新團隊(2012KCT-20)。

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.02.016