劉同帥,邱智東,翁麗麗,郝　潔,翁　硯

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué),長(zhǎng)春 130117；2.白求恩醫(yī)科大學(xué)制藥廠,長(zhǎng)春 130012)

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哈蟆油發(fā)酵乳中蛋白質(zhì)及氨基酸含量分析

劉同帥1,邱智東1,翁麗麗1,郝潔1,翁硯2*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué),長(zhǎng)春 130117；2.白求恩醫(yī)科大學(xué)制藥廠,長(zhǎng)春 130012)

摘要：目的建立哈蟆油發(fā)酵乳中蛋白質(zhì)及氨基酸含量分析方法。方法運(yùn)用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定哈蟆油發(fā)酵乳中蛋白質(zhì)含量，運(yùn)用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定哈蟆油發(fā)酵乳中氨基酸的含量。結(jié)果3批哈蟆油發(fā)酵乳蛋白含量分別為8.050 1、8.093 0、7.758 2 mg/mL。平均總氨基酸的含量為15.320 5 mg/mL。結(jié)論哈蟆油發(fā)酵乳中含有合成人體所需蛋白質(zhì)及豐富的氨基酸。

關(guān)鍵詞：蛤蟆油發(fā)酵乳；考馬斯亮藍(lán)法；蛋白質(zhì)；氨基酸

哈蟆油具有補(bǔ)腎益精，養(yǎng)陰潤(rùn)肺的功效。哈蟆油發(fā)酵乳由現(xiàn)代生物技術(shù)制得，將哈蟆油中大分子蛋白類轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì)，更利于人體吸收利用。

1材料

1.1樣品哈蟆油發(fā)酵乳，由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥劑實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2試劑BSA標(biāo)準(zhǔn)品(5 mg/mL)；考馬斯亮藍(lán)G-250；混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；95%的乙醇；85%的磷酸；HCl溶液(北京化工廠)。

1.3儀器旋渦混合器、紫外分光光度計(jì)、氨基酸自動(dòng)分析儀。

2方法與結(jié)果

2.1蛋白質(zhì)含量測(cè)定[1-4]

2.1.1對(duì)照品溶液的制備精密移取1 mL BSA標(biāo)準(zhǔn)品(5 mg/mL)，置于5 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度線，搖勻，得1 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.2供試品溶液的制備精密量取哈蟆油發(fā)酵乳2 mL，置于10 mL的容量瓶中，用去離子水定容至刻度線。

2.1.3顯色劑的配制考馬斯亮藍(lán)G-250染料試劑：稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50 mL乙醇中，再加入85%的磷酸100 mL，用水稀釋至1 000 mL。

2.1.4線性關(guān)系考察分別精密加入BSA對(duì)照品溶液0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL置于10 mL的具塞試管中，用去離子水補(bǔ)充至0.1 mL。再加入5 mL的考馬斯亮藍(lán)溶液，至于旋渦混合器上混勻。以去離子水作為空白，測(cè)定其在596 nm波長(zhǎng)下的吸光度值，結(jié)果見表1。

表1　線性關(guān)系考察結(jié)果

以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：A=0.485 38C+0.010 12，r=0.999 5。結(jié)果表明BSA對(duì)照品在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5精密度考察精密量取BSA對(duì)照品溶液0.1 mL，依法連續(xù)測(cè)定6次，分別記錄其吸光度A值，計(jì)算RSD%。結(jié)果RSD值為0.10%，說明儀器的精密度良好，其測(cè)定結(jié)果真實(shí)可信。

2.1.6穩(wěn)定性考察分別精密吸取BSA對(duì)照品溶液0.1 mL，供試品溶液0.04 mL，依法測(cè)定，分別記錄時(shí)間為0、4、8、12、16、20 min時(shí)對(duì)照品溶液和供試品溶液的吸光度值，并分別計(jì)算RSD%。結(jié)果對(duì)照品溶液的RSD值為0.19%，供試品溶液的RSD值為1.07%，二者在20 min之內(nèi)的穩(wěn)定性均良好。

2.1.7重現(xiàn)性考察取同一批號(hào)樣品，按供試品溶液的制備方法處理，平行處理6份，依法測(cè)定吸光度值，并計(jì)算RSD%。結(jié)果樣品的蛋白質(zhì)含量平均值為8.422 4 mg/mL，RSD值為1.52%，表明此方法的重現(xiàn)性良好。

2.1.8加樣回收率考察精密吸取0.02 mL已知含量(8.422 4 mg/mL)的供試品溶液，共稱取6份，置于10 mL具塞試管中，以蛋白質(zhì)和BSA對(duì)照品含量比例1∶1加入，依法測(cè)定吸光度值，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果平均回收率為100.74%，RSD值為2.01%，說明此方法穩(wěn)定可行。

2.2哈蟆油發(fā)酵乳蛋白質(zhì)含量測(cè)定取3批哈蟆油發(fā)酵乳，按供試品溶液的制備方法處理，依法測(cè)定吸光度值，并計(jì)算其蛋白質(zhì)含量。結(jié)果平均含量為7.967 1 mg/mL。

2.3氨基酸含量測(cè)定

2.3.1對(duì)照品溶液的制備準(zhǔn)確吸取一定量的混合氨基酸基準(zhǔn)液，稀釋到一定濃度，測(cè)定氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3.2供試品溶液的制備精密稱取樣品0.4 g置于水解管內(nèi)，加入6 mol/L HCl溶液10 mL，用氮?dú)鈱⑺夤軆?nèi)的空氣排凈，置于110 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)水解22 h。水解完成后，常溫放置冷卻，將水解液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用去離子水反復(fù)沖洗水解管，并將洗液移入容量瓶中，加去離子水定容至刻度線，搖勻，過濾，準(zhǔn)確稱取濾液0.5 mL，用氮?dú)獯蹈桑?.02 mol/L HCl溶液1 mL溶解，微孔濾膜過濾，即得。

2.3.3測(cè)定法準(zhǔn)確吸取20 μL混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及供試品溶液，用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行測(cè)定。

2.4哈蟆油發(fā)酵乳中氨基酸含量測(cè)定取3批哈蟆油發(fā)酵乳，按供試品溶液的制備方法處理，按測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算其氨基酸的含量。結(jié)果見表2。

表2　氨基酸測(cè)定結(jié)果　mg/mL

3小結(jié)

哈蟆油中含有多種化學(xué)成分,其中主要成分是蛋白質(zhì)[5-13],將哈蟆油利用現(xiàn)代生物發(fā)酵技術(shù)，制成新型保健品哈蟆油發(fā)酵乳，測(cè)得的其中蛋白質(zhì)平均含量為7.967 1 mg/mL, 平均總氨基酸含量15.320 5 mg/mL。

哈蟆油發(fā)酵乳不僅改變了哈蟆油原有的口感，而且含有大量人體所需的蛋白質(zhì)及氨基酸，能夠增強(qiáng)人體的免疫力,緩解體力疲勞,作為營(yíng)養(yǎng)保健品，具有廣闊的發(fā)展前景。

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Analysis of protein and amino acid content of Oviductus Ranae in fermented milk

LIU Tongshuai1,QIU Zhidong1,WENG Lili1,HAO Jie1,WENG Yan2*

(1.Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China;2.The Pharmaceutical Factory,Norman Bethune Medical University,Changchun 130012,China)

Abstract：ObjectiveTo establish a method for analysis of protein and amino acidcontent of Ranae Oviductus fermented milk.MethodsUsing Coomassie bright blue for determination of Ranae Oviductus fermented milk protein content,determination of the content of amino acids by automatic amino acid analyzer.ResultsThe three batch of Ranae Oviductus fermented milk protein content were 8.050 1,8.093 0,7.758 2 mg/mL.The average total amino acid content was 15.320 5 mg/mL.ConclusionRanae Oviductus in fermented milk containing synthetic human body needs protein rich amino acids.

Keywords：Ranae Oviductus fermented milk;Kaumas Bradford method;protein;amino acid

(收稿日期:2015-11-30)

文章編號(hào)：2095-6258(2016)02-0261-03

中圖分類號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

*通信作者：翁硯，女，工程師，電話-17804315162，電子信箱-weng1969@sohu.com

作者簡(jiǎn)介：劉同帥(1991-)，女，碩士研究生，主要從事中藥學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20120912)。

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.02.014