陳　偉,田　魯,王 　港,李　易，2*

(1.黃石市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北 黃石 435000；2.湖北理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 黃石 435000)

?

苦瓜總皂苷對2型糖尿病腎病大鼠腎臟細(xì)胞間纖連蛋白和膠原Ⅳ蛋白表達(dá)的影響

陳偉1,田魯1,王 港1,李易1，2*

(1.黃石市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北 黃石 435000；2.湖北理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 黃石 435000)

摘要：目的探討苦瓜總皂苷對2型糖尿病腎病大鼠細(xì)胞間纖連蛋白(FN)和膠原Ⅳ蛋白(Ⅳ-CP)表達(dá)的影響。方法雄性SD大鼠48只隨機(jī)分為正常對照組、2型糖尿病腎病模型組及苦瓜總皂苷5 mg/(kg·d)，治療組左腎切除加1次大劑量鏈脲佐菌素腹腔注射建立動(dòng)物模型，正常對照組和模型組給予生理鹽水灌胃，苦瓜總皂苷治療組給予苦瓜總皂苷灌胃，分別于實(shí)驗(yàn)第4、8周處死大鼠各半，測血糖、24 h尿蛋白定量以及炎性因子；免疫組化、RT-PCR以及Western Blot檢測FN和Ⅳ-CP蛋白的表達(dá)。結(jié)果治療組尿蛋白和血清肌酐與模型組相比明顯減少，血糖明顯升高(P<0.05)；免疫組化、RT-PCR和Western Blot與模型組相比治療組大鼠腎臟組織FN和Ⅳ-CP表達(dá)明顯降低(P<0.05)。結(jié)論苦瓜總皂苷可以通過抑制糖尿病腎病大鼠腎組織細(xì)胞間纖連蛋白和Ⅳ型膠原的表達(dá)，改善腎功能。

關(guān)鍵詞：苦瓜總皂苷;2型糖尿病腎病大鼠;纖連蛋白;Ⅳ型膠原

近年來隨著人民生活水平的提高，特別是飲食結(jié)構(gòu)的改變，2型糖尿病的發(fā)病率逐年增高[1]，研究[2]顯示，控制不佳的2型糖尿病患者約三分之一可發(fā)展為糖尿病腎病。有文獻(xiàn)報(bào)道[3]苦瓜總皂苷對2型糖尿病有一定的治療作用，但鮮見對糖尿病腎病的研究報(bào)道，本研究通過建立2型糖尿病腎病大鼠模型并給予其苦瓜總皂苷干預(yù)，以期明確在治療2型糖尿病腎病方面的作用機(jī)制，為本藥的開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物選取清潔級(jí)雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量180～200 g，購自華中科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，大鼠合格證號(hào)為SCXK(鄂)2010-0009，適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)。

1.2動(dòng)物分組及造模方法大鼠隨機(jī)分成正常對照組、2型糖尿病腎病模型組以及苦瓜總皂苷干預(yù)治療組3組，其中糖尿病腎病組和模型組施行單側(cè)腎切除手術(shù):1)用1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)將大鼠麻醉，麻醉后將其固定于固定板上；2)切開大鼠腹部找到左腎；3)將大鼠左腎蒂部位結(jié)扎并摘除，之后給予青霉素腹腔注射后縫合；4)正常組大鼠采用同樣方法處理大鼠，但腎臟不摘除。5)術(shù)后每天給予大鼠肌注1次青霉素，時(shí)間為1周。后予大鼠再飼養(yǎng)3周，3周后，糖尿病腎病組以及模型對照組大鼠給予鏈脲佐菌素50 mg/kg行1次性腹腔注射，注射3 d后尾靜脈取血，取血后血糖儀測定血糖，測定空腹血糖大于16.7 mmol/L的大鼠判定為造模成功。

模型建立成功后，正常對照組和模型組給予生理鹽水灌胃，苦瓜總皂苷治療組給予苦瓜總皂苷灌胃，模型成功后于實(shí)驗(yàn)2、4、6、8周末分別測大鼠血糖水平；分別于實(shí)驗(yàn)第4、8周處死大鼠各半，測24 h尿蛋白定量；取腎組織做HE染色行腎組織病理觀察、RT-PCR以及Western Blot檢測腎組織FN和IV-CP蛋白和mRNA表達(dá)。

1.3標(biāo)本收集

1.3.1尿液標(biāo)本收集分別于治療4、8周后，每組隨機(jī)取8只大鼠置于代謝籠收集24 h尿液并計(jì)算總尿量。24 h尿蛋白量采用公式為：24 h尿蛋白量(mg)=尿蛋白濃度(g/L)×24 h尿量(mL)。

1. 3.2血液標(biāo)本收集第2、6周采用斷尾法收集大鼠血液，第4、8周與禁食12 h后，用10%水合氯醛(2.0 mL/kg)給予大鼠腹腔注射麻醉。麻醉完成后沿大鼠腹中線切開皮膚和肌肉，將心臟暴露，之后用10 mL注射器插入心尖取血，取血后摘除右腎備用檢測。全自動(dòng)生化分析儀測定血清白蛋白及血清肌酐值。

1.4免疫組化肝臟組織切片后室溫中平衡10 min之后用預(yù)冷丙酮固定后晾干，晾干后采用PBS緩沖液沖洗3次，沖洗完成后用0.3%的H2O2室溫浸泡10 min，再用PBS緩沖液沖洗3次；滴加一抗，16 h后，采用PBS緩沖液沖洗3次后滴加二抗，室溫孵育1 h。PBS再?zèng)_洗3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，水洗后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.5RT-PCR檢測大鼠腎組織中FN和IV-CP mRNA表達(dá)腎臟組織用天根總RNA試劑盒提取后，定量，并行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增條件如下：94 ℃預(yù)變性2 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸6 min。引物序列見表1。

表1　纖連蛋白和Ⅳ型膠原引物

1.6Western Blot檢測大鼠腎組織中纖連蛋白和Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)稱取100 mg腎臟組織，電子勻漿機(jī)磨碎，低溫高速勻漿機(jī)離心，4 000 r/min，離心后取上清液分裝于1 mL的離心管中并置于超低溫冰箱中保存，電泳時(shí)每組各取樣本60 μg進(jìn)行蛋白電泳，電泳方法按照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行，收集到電泳圖片后用Image J計(jì)算各條帶的灰度值，Image J計(jì)算灰度值。

2結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)大鼠一般情況從造模成功后開始記錄大鼠一般情況，正常組大鼠飲食、飲水、精神狀態(tài)以及平?；顒?dòng)均正常，同時(shí)毛發(fā)光滑；模型組大鼠均呈現(xiàn)出明顯的多尿、多飲、多食等癥狀，其精神明顯不佳，此外毛發(fā)可見其明顯雜亂，同時(shí)表現(xiàn)有淡黃色(可能沾有尿液)，治療組大鼠在治療4周后相較于正常組飲食也呈增加的趨勢，但沒有模型組增加量大，治療8周后與治療4周后基本一致。

2.2大鼠血糖、24 h尿蛋白定量及血肌酐和血漿白蛋白變化見表2、表3。

表2　對大鼠血糖變化的影響　mmol/L

注：與模型組相比，#P<0.05

表3　對大鼠24 h蛋白尿量、血肌酐和血漿白蛋白變化的影響±s，n=18)

注：與模型組相比，#P<0.05

2.3大鼠腎臟組織中FN和IV-CP mRNA表達(dá)見表4。

2.4大鼠腎臟組織中FN和IV-CP 蛋白表達(dá)見表5。

組 別FN治療4周治療8周IV-CPmRNA治療4周治療8周正常組1.24±0.241.23±0.25 0.83±0.17 0.92±0.24 模型組2.35±0.461.64±0.26 1.41±0.15 1.69±0.19 治療組1.29±0.261.31±0.23#1.06±0.16#1.02±0.17#

注：與模型組相比，#P<0.05

組 別FN治療4周治療8周IV-CP治療4周治療8周正常組0.87±0.19 0.89±0.17 1.27±0.26 1.15±0.18 模型組1.86±0.28 1.72±0.27 3.22±0.27 3.42±0.26 治療組1.59±0.31#1.54±0.16#1.93±0.26#1.82±0.32#

注：與模型組相比，#P<0.05

2.5FN和IV-CP免疫組化免疫組化可見，空白組大鼠腎臟組織中FN和IV-CP呈低表達(dá)狀態(tài)，模型組FN和IV-CP表達(dá)明顯升高，苦瓜總皂苷治療4周后有一定降低，治療8周后進(jìn)一步降低。

3討論

關(guān)于2型糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制的研究目前有許多的學(xué)說[5-10],研究較多的有基因氧化應(yīng)激學(xué)說、遺傳學(xué)說、炎癥學(xué)說、代謝障礙學(xué)說、血流動(dòng)力學(xué)改變學(xué)說等，但具體為哪種發(fā)病機(jī)制造成本病的發(fā)生以及后續(xù)進(jìn)展目前還沒有明確的定論，但不管是哪種機(jī)制，哪種信號(hào)通路影響，其對腎臟的改變是毫無疑問的。腎臟組織學(xué)改變除了研究中較多見到腎小球肥大、腎小球炎癥等外，在腎臟細(xì)胞間的細(xì)胞外基質(zhì)聚集、基底膜增厚等也是最典型的特點(diǎn)。目前國外許多專家均將細(xì)胞外基質(zhì)的積聚作為治療糖尿病腎病進(jìn)展的一個(gè)熱點(diǎn)，關(guān)于腎臟中細(xì)胞外基質(zhì)的常見蛋白有纖維連接蛋白、Ⅴ型膠原蛋白、Ⅳ型膠原蛋白、層黏連蛋白以及一些蛋白多糖等。當(dāng)腎臟受到長期的高血糖、高炎性因子浸潤后，可造成腎臟細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，從而腫脹，這種細(xì)胞的腫脹又可造成病理和細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)錄蛋白的激活，進(jìn)而分泌過量的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，最終造成腎臟的損害和進(jìn)展[11-15]。

苦瓜其本身屬于葫蘆科苦瓜屬植物苦瓜MomordicacharantiaL的未成熟果實(shí)的一種，也是我國常見的菜系，但關(guān)于其藥用機(jī)理人們了解甚少，苦瓜有著悠久的入藥史，其中《本草綱目》描述，苦瓜苦寒無毒，其可解勞乏，除邪熱，清心明目。現(xiàn)代許多學(xué)者對苦瓜進(jìn)行了大量的研究，研究均提示苦瓜具有明顯的抗氧化、提高免疫力、降血糖、降低膽固醇、甚至可以抗艾滋病病毒的作用[16-17]。本次作者用苦瓜總皂苷治療2型糖尿病腎病大鼠，研究顯示：苦瓜總皂苷不僅有降低血糖的作用，同時(shí)也可明顯改善2型糖尿病大鼠24 h尿量、尿蛋白以及血清肌酐；同時(shí)也可抑制大鼠腎臟細(xì)胞間FN和IV-CP蛋白和mRNA的表達(dá)，具有很好的藥用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1]韓卓笑,牛尚梅,王蕓,等.肥胖與2型糖尿病腎病的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2015,21(3):488-490.

[2]BONDEVA T,HEINZING J,RUHE C,et al.Advanced glycated end-products affect HIF-transcriptional activity in renal cells[J].Mol Endocrinol,2013,27(11):1918-1933.

[3]柴瑞華,肖春瑩,關(guān)健,等.苦瓜總皂苷降血糖作用的研究[J].中草藥,2008,39(5):746-751.

[4]武俊紫,賈亞敏,沈平瑞,等.富硒靈芝調(diào)控大鼠乙酰輔酶A羧化酶α表達(dá)治療非酒精性脂肪肝病的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2014,26(6):1086-1092.

[5]THALLAS-BONKE V,JHA J C,GRAY S P,et al.Nox-4 deletion reduces oxidative stress and injury by PKC-α-associated mechanisms in diabetic nephropathy[J].Physiol Rep,2014,2(11):12192.

[6]王愛民,雷閩湘,劉澤灝,等.2型糖尿病腎病危險(xiǎn)因素分析[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2005,15(1):116-119.

[7]SEO J W,KIM Y G,LEE S H,et al.Mycophenolate Mofetil Ameliorates Diabetic Nephropathy in db Mice[J].Biomed Res Int,2015(30):1627.

[8]曹蓓,王旭.糖尿病腎病的中醫(yī)藥治療進(jìn)展[J].吉林中醫(yī)藥,2015,35(4):430-432.

[9]EBOH C,CHOWDHURY T A.Management of diabetic renal disease[J].Ann Transl Med,2015,3(11):154.

[10]韓雪華.糖尿病腎病中醫(yī)藥治療近況[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2013,29(4):742-743.

[11]WONG M,SAAD S,ZHANG J,et al.Semicarbazide-sensitive amine oxidase (SSAO) inhibition ameliorates kidney fibrosis in a unilateral ureteral obstruction murine model[J].Am J Physiol Renal Physiol,2014,307 (8):F908-F916.

[12]XU W,SHAO X,TIAN L,et al.Astragaloside IV ameliorates renal fibrosis via the inhibition of mitogen-activated protein kinases and antiapoptosis in vivo and in vitro[J].J Pharmacol Exp Ther,2014,350 (3):552-562.

[13]AHAD A,AHSAN H,MUJEEB M,et al.Gallic acid ameliorates renal functions by inhibiting the activation of p38 MAPK in experimentally induced type 2 diabetic rats and cultured rat proximal tubular epithelial cells[J].Chem Biol Interact,2015,240(1):292-303.

[14]YONEKURA Y,FUJII H,NAKAI K,et al.Anti-oxidative Effect of the β-blocker Carvedilol on Diabetic Nephropathy in Non-obese Type 2 Diabetic Rats[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2015,42(9):12447.

[15]ELLEIN MREICH,XING-MING CHEN,AMGAD ZAKY,et al.The role of Krüppel-like factor 4 in transforming growth factor-β-induced inflammatory and fibrotic responses in human proximal tubule cells[J].2015,42(6):680-686.

[16]董英,張慧慧.苦瓜多糖降血糖活性成分的研究[J].營養(yǎng)學(xué)報(bào),2008,30(1):54-56.

[17]馬春宇,于洪宇,王慧嬌,等.苦瓜總皂苷對2型糖尿病大鼠降血糖作用機(jī)制的研究[J].天津醫(yī)藥,2014,42(4):321-324.

Total saponins of bitter gourd to fibronectin and collagen Ⅳ in type 2 diabetic nephropathy rat

CHEN Wei1,TIAN Lu1,WANG Gang1,LI Yi1,2*

(1.Department of Kidney,Huangshi Central Hospital,Huangshi 435000,Hubei Province,China;2.Medical College,Hubei Polytechnic University,Huangshi 435000,Hubei Province,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of total saponins from bitter to the expression of fibronectin and collagen Ⅳin 2 diabetic nephropathy rats.MethodsMale SD rats were randomly divided into normal control group,diabetic nephropathy model group and saponins treatment group (5 mg/kg·d treatment) and left renal resection plus a large dose of streptozocin (STZ) intraperitoneal injection of established animal model,after successful built model,normal control group and model group were given physiological saline by gavage,treatment group give saponins gavage,respectively in the 4 weeks,8 weeks half of rats were sacrificed,measuring glucose,24 h urine protein quantitative and inflammatory factors;immunohistochemistry,RT-PCR and Western blot detection of renal fibrosis even protein and collagen Ⅳ expression.ResultsThe serum creatinine and serum creatinine in the treatment group were significantly decreased compared with the model group,the difference was significant (P<0.05);After treatment,Immunohistochemistry,RT-PCR and Blot Western showed that:compared with the model group,the expression of fibronectin and type Ⅳ collagen protein in the kidney tissue was significantly lower than that in the treatment group (P<0.05).ConclusionTotal saponins from bitter gourd can inhibit the expression of fibronectin and type Ⅳ collagen in renal tissue of diabetic nephropathy rats,and improve renal function.

Keywords：total saponins of bitter gourd;type 2 diabetic nephropathy rats;fibronectin;Ⅳ collagen protein

(收稿日期:2015-10-09)

文章編號(hào)：2095-6258(2016)02-0237-04

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

*通信作者：李易，女，碩士，副主任醫(yī)師，電話-13597617350，電子信箱-hsyiyuantougao@163.com

作者簡介：陳偉(1980-)，男，碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事腎病的內(nèi)科治療及腎臟透析。

基金項(xiàng)目：湖北省科技廳面上項(xiàng)目“苦瓜總皂苷對2型糖尿病腎病大鼠的治療作用”(2013FFA003)。

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.02.006