呂勇智 李宏達(dá) 鄒 寧 張 碩 朱 昱（中國(guó)刑事警察學(xué)院 遼寧 沈陽(yáng) 110035）

新型熒光探針?lè)z測(cè)食品中的亞硫酸鹽含量

呂勇智 李宏達(dá) 鄒 寧 張 碩 朱 昱
（中國(guó)刑事警察學(xué)院 遼寧 沈陽(yáng) 110035）

亞硫酸鹽是常見(jiàn)的食品添加劑，然而對(duì)人體卻有一定的毒性。通過(guò)設(shè)計(jì)、合成了一種新型的基于羥基半花菁染料的熒光探針（HHC），可以實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、高效地檢測(cè)食品檢材中的亞硫酸氫根。探針?lè)肿泳哂休^大的摩爾消光系數(shù)，可以實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)。另外，HHC探針熒光強(qiáng)度的變化量與濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，并具有較低的極限檢測(cè)濃度，可成功的應(yīng)用于食品檢材中濃度水平的監(jiān)測(cè)。

熒光探針 亞硫酸鹽檢測(cè) 定量分析 食品檢材

食品安全是一個(gè)重大的戰(zhàn)略性問(wèn)題，事關(guān)人民的身體健康和社會(huì)的和諧穩(wěn)定。食品添加劑是食品中的必要成分，對(duì)食品添加劑的檢驗(yàn)已日漸成為食品安全領(lǐng)域的一項(xiàng)重要工作[1]。亞硫酸鹽（或）常作為食品和飲料中的添加劑，是一類很早就在世界范圍內(nèi)廣泛使用的食品添加劑。然而亞硫酸鹽具有一定毒性，大量的攝入可能導(dǎo)致皮膚過(guò)敏，呼吸道疾?。ㄈ缦?，胃腸道疾病及臟器損傷等[2-3]。美國(guó)食品藥物管理局（The United States Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）規(guī)定食物中的亞硫酸鹽的含量不得超過(guò)10μg/mL[4]。

目前，檢測(cè)亞硫酸鹽的方法有很多種，例如滴定法[5]、蒸餾法[6]、比色法[7]、離子色譜法[8]、分光光度法[9]、電化學(xué)法[10]、毛細(xì)管電泳法[11]、酶催化法[12]等。這些方法中或者由于前處理比較繁瑣，需要借助大型分析儀器，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，或者存在靈敏度低，選擇性差等缺點(diǎn)，因而在食品檢材中對(duì)于微量亞硫酸鹽的檢測(cè)受到一定限制。熒光探針?lè)╗13-21]具有靈敏度高、選擇性好、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，引起了許多科學(xué)家的關(guān)注。本文設(shè)計(jì)合成了基于羥基半花菁染料的熒光探針HHC。該探針存在著非常強(qiáng)的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT），在長(zhǎng)波長(zhǎng)處產(chǎn)生非常強(qiáng)的紅色熒光信號(hào)；當(dāng)亞硫酸鹽與探針HHC中的C=C作用后，阻礙了ICT作用，導(dǎo)致紅色熒光信號(hào)發(fā)生猝滅，且測(cè)得的熒光信號(hào)變化量與加入的亞硫酸鹽濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。本文在優(yōu)化反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，建立了檢測(cè)食品檢材中亞硫酸鹽含量的新型熒光探針?lè)āＴ摲椒ň哂胁僮骱?jiǎn)便，響應(yīng)快速，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，存在著巨大的應(yīng)用前景。探針HHC的合成路線及與HSO3-的作用機(jī)理如圖1所示。

圖1 探針HHC的合成路線及與的作用機(jī)理

1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

熒光和紫外分光光度計(jì)采用島津公司的RF-5301PC和UV-2550進(jìn)行測(cè)試，核磁共振儀采用Bruker AV-300進(jìn)行測(cè)試，MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀采用島津公司的AXIMA-CFRTM進(jìn)行測(cè)試，HRMS (ESI-TOF)采用Bruker microTOF II focus進(jìn)行測(cè)試。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的原料樣品及溶劑均來(lái)自國(guó)藥控股有限公司，購(gòu)買后未經(jīng)處理直接使用。水，冰糖，紅酒，白砂糖均采購(gòu)于沈陽(yáng)家樂(lè)福超市。層析硅膠采購(gòu)于青島海洋化工特種硅膠有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

2.1 熒光探針HHC的合成及表征

將200mg濃度為1.2mmol的碘化3-乙基-2-甲基-3-苯并噻唑（2）和354mg濃度為1.2mmol的8-羥基-5-喹啉甲醛（1）溶于5.0mL的無(wú)水乙醇中，然后添加2滴哌啶溶液作為反應(yīng)的催化劑，在N2環(huán)境中，加熱回流4小時(shí)，然后冷卻至室溫，加入適量的乙醚，將析出的晶體過(guò)濾，再用乙醇重結(jié)晶析出灰白色固體HHC （265.2mg）產(chǎn)率為48%。1H NMR（300MHz，DMSO-d6，ppm）δ：9.06（d，J=8.6Hz，1H，ArH），9.00（d，J=3.9Hz，1H，ArH），8.84（d，J=15.2Hz，1H，-CH=CH-Ar），8.64（d，J=8.3Hz，1H，ArH），8.45（d，J=8.1Hz，1H，ArH），8.31（d，J=8.4Hz，1H，ArH），8.05（d，J=15.3Hz，1H，-CH=CH-Ar），7.89（t，J=7.4Hz，1H，ArH），7.82-7.78（m，2H，ArH），7.33(d，J=8.4Hz，1H，ArH），5.00（q，J=6.8Hz，2H，-CH2-CH3），1.50（t，J=6.7Hz，3H，-CH2-CH3）.13C NMR（75MHz，DMSO-d6，ppm）δ：162.2，147.3，141.7，140.6，136.1，132.4，131.0，128.2，125.2，125.1，124.9，124.7，123.1，122.3，114.1，113.8，112.8，95.0，44.3，13.0.MALDI-TOF Ms m/z：333.4 [M-I]+，HRMS（ESI-TOF）Calcd for C20H17N2OS+（[M]+）333.1056.Found：333.1063。

用二甲基亞砜（DMSO）作為溶劑制備5× 10-4mol/L HHC儲(chǔ)備液，并用磷酸鹽緩沖液(10mmol/L，pH=7.4，2%DMSO)將其稀釋到1×10-5mol/L。其他溶液用磷酸鹽緩沖溶液(10mmol/L，pH=7.4，2%DMSO)溶解制備。在25℃下，采用10mm比色皿，吸收光譜掃描范圍是200nm到700nm，找到HHC探針的最大吸收波長(zhǎng)為568nm。然后配置不同濃度的溶液，往HHC探針溶液中滴加溶液，振蕩搖勻并以568nm為激發(fā)波長(zhǎng)，狹縫寬度5nm，掃描范圍為550nm到800nm，測(cè)得與HHC探針混合液的熒光發(fā)射光譜圖。

用去離子水作為溶劑制備濃度均為0.25g/mL的冰糖和白砂糖儲(chǔ)備液，并用去離子水將紅酒稀釋100倍。然后將適量的(0，0.15或0.20μmol/L)樣品儲(chǔ)備液、HHC溶液(10μmol/L)加入3mL磷酸鹽緩沖溶液(10mmol/L，pH7.4，2%DMSO)中，并在25℃條件下測(cè)定熒光強(qiáng)度。

2.4 檢測(cè)限（LOD）

本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)限用LOD=3δ/k表示，δ指10次空白測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差，k指擬合曲線的斜率。

3 結(jié)果與討論

3.1 光譜性質(zhì)

由于大多數(shù)亞硫酸鹽是添加在食物中，所以要求熒光探針在水介質(zhì)中也可以進(jìn)行測(cè)定。本文考察了不同pH濃度對(duì)熒光探針HHC測(cè)定的影響（如圖2所示）。結(jié)果顯示當(dāng)溶液pH在7.4～9.0之間，在激發(fā)波長(zhǎng)568nm測(cè)定下HHC的熒光強(qiáng)度最大，而當(dāng)pH降到4，吸收帶藍(lán)移，最大吸收波長(zhǎng)從568nm移動(dòng)到431nm，紫紅色溶液變?yōu)辄S色（如圖3所示）。由此可見(jiàn)，HHC在弱堿性溶液中去質(zhì)子化，此時(shí)探針HHC的最大吸收波長(zhǎng)為568nm，呈現(xiàn)紫紅色，且最大發(fā)射波長(zhǎng)為591nm（激發(fā)波長(zhǎng)為568nm，如圖6所示）。HHC與結(jié)合前，由于分子內(nèi)電荷的轉(zhuǎn)移（亞胺離子和酚羥基上氧負(fù)離子相互作用），使得HHC產(chǎn)生了強(qiáng)烈的熒光效應(yīng)。而當(dāng)(50mol/L)加入到HHC溶液中，在568nm和591nm處的最大吸收峰和最大發(fā)射峰消失，溶液顏色從紫紅變?yōu)闊o(wú)色。由于反應(yīng)前后產(chǎn)生明顯的顏色變化，因此，HHC能夠用于的可視化檢測(cè)。另外，根據(jù)滴定曲線和Job擬合曲線可知，HHC和之間的化學(xué)計(jì)量比為1∶ 1（如圖4所示），通過(guò)ESI-MS可知，[HHC-HSO3]+=415.51，也進(jìn)一步證明了兩者之間的化學(xué)計(jì)量比為1∶1，同時(shí)也印證了圖1所示的反應(yīng)機(jī)理。

圖2 不同pH條件下探針HHC的熒光強(qiáng)度

圖3 探針HHC(10μmol/L)在pH分別為4.0、7.4和9.0時(shí)的吸收譜圖

圖4 探針HHC與作用的Job擬合曲線

在發(fā)射光譜中，我們可以看到在591nm處混合溶液的熒光強(qiáng)度隨著濃度的增加而逐漸減弱，并且熒光強(qiáng)度的變化量與加入的濃度（0～10μmol/L）呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系（R2=0.999，如圖6所示），檢測(cè)極限為6.8mol/L。

圖5 探針HHC(10μmol/L)響應(yīng)的吸收光譜圖

圖6 探針HHC（10μmol/L）響應(yīng)的發(fā)射光譜圖

在室溫條件下，對(duì)探針HHC與類似分析物之間的相互作用進(jìn)行了研究（分析物包含：陰離子、氧化劑和生物硫醇，如圖7所示）。柱狀圖結(jié)果表明：僅有能夠使探針HHC在591nm處的發(fā)射峰消失，其他分析物與HHC不發(fā)生作用，探針HHC與的相互作用不受其他分析物的干擾。因此，探針HHC可應(yīng)用于復(fù)雜樣品中的檢測(cè)。

圖7 探針HHC（10μmol/L）識(shí)別的選擇性和干擾性柱狀圖

實(shí)驗(yàn)選取自來(lái)水、冰糖、稀釋的紅酒和白砂糖作為待測(cè)食品檢材，利用探針HHC對(duì)待測(cè)檢材進(jìn)行分析。結(jié)果表明，探針HHC可以快速、準(zhǔn)確、高效地識(shí)別食品檢材中及加標(biāo)樣品中的，且都獲得了非常理想的回收率（93.3%～101.4%，如表1所示）。此外，利用我們的檢測(cè)方法和傳統(tǒng)的滴定法對(duì)同一食品檢材進(jìn)行分析，獲得了一個(gè)高度吻合的結(jié)果（如表2所示）。

Sample HSO3-level(μM) NaHSO3 added(μM) NaHSO3 founded by HHC(μM) Recovery% Tap water - - - -1 0.15 0.14±0.008 93.3 2 0.20 0.20±0.009 100.0 Crystal sugar 1.62 - - -1 0.15 1.76±0.012 99.4 2 0.20 1.81±0.022 99.5 Diluted Red wine 0.54 - - -1 0.15 0.70±0.015 101.4 2 0.20 0.73±0.012 98.6 Granualared sugar 2.22 - - -1 0.15 2.36±0.024 99.6 2 0.20 2.41±0.031 99.6

表2 傳統(tǒng)滴定法與探針HHC比較分析結(jié)果

4 結(jié)論

本文成功合成了基于羥基半花菁染料的熒光探針HHC，并將其應(yīng)用于復(fù)雜樣品中的定性與定量分析。結(jié)果表明，探針HHC不僅能夠快速、高靈敏度、高選擇性地識(shí)別

，而且還可以實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)的目的。探針HHC的熒光強(qiáng)度變化量與加入的濃度（0～10μmol/L）呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系，極限檢測(cè)濃度為6.8nmol/L，可被成功地應(yīng)用于食品檢材中濃度水平監(jiān)測(cè)。此外，這種新型熒光探針?lè)ǖ难芯靠梢源龠M(jìn)食品、環(huán)保等公共安全領(lǐng)域中無(wú)機(jī)毒性離子的檢測(cè)與鑒定的發(fā)展。

[1]陳玉梅.亞硫酸鹽類在食品中的應(yīng)用及殘留控制[J].檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊,2010,3(3):22-24.

[2]黨衛(wèi)紅.亞硫酸鹽的毒性作用[J].河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2008,19(4):318-320.

[3]周志權(quán),溫韜,吳保壯.HACCP在亞硫酸法白砂糖生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].廣西科學(xué)院學(xué)報(bào),2008,24(1): 16-18.

[4]SYue,Z Dong,F Shanwei,et al.A Ratiometric Fluorescent Probefor Rapid Detection of Bisulfitethrough 1,4-Addition Reaction in Aqueous Solution[J].Journal of Agricultural&Food Chemistry,2014,62(15)：3405-3409.

[5]王若燕,郁欣,周曉萍.直接碘量法測(cè)定銀耳中的二氧化硫殘留量[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)信息,2000,6(1):63.

[6]老倩群,梁志華.對(duì)蒸餾法測(cè)定亞硫酸鹽的幾點(diǎn)看法[J].廣東衛(wèi)生防疫,1998,24(3):11-12.

[7]張靜,耿振新,吳建軍.鹽酸副玫瑰苯胺比色法測(cè)定食品中亞硫酸鹽方法的要點(diǎn)及改進(jìn)[J].職業(yè)與健康,2010,26(13):1483-1484.

[8]劉喆,劉克納,宋強(qiáng),等.離子排斥色譜法、脈沖安培檢測(cè)器對(duì)食品中亞硫酸及其鹽的分析與檢測(cè)[J].食品與發(fā)酵工業(yè),1997,23(4):19-20.

[9]SSM Hassan,MSA Ha mza,AHK Mohamed.A Novel Spectrophotometric Method for Batch and Flow Injection Determination ofSulfitein Beverages[J].Analytica ChimicaActa,2006,570(2):232-239.

[10]游京晶,李冬梅,戚苓,等.電位滴定法測(cè)定食品中的亞硫酸鹽[J].食品與發(fā)酵工業(yè),1992(3):60-66.

[11]G Jankovskiene,Z Daunoravicius,A Padarauskas.CapillaryElectrophoreticDeterminationofSulfiteUsingthe Zone-passing Technique ofin-capillary Derivatization [J].JournalofChromatographyA,2001,934(1-2):67-73.

[12]L He,W Lin,Q Xu,et al.A Unique Type of Pyrrole-Based Cyanine Fluorophores with Turn-on and Ratiometric Fluorescence Signalsat Different pH Regions for Sensing pH in Enzymesand Living Cells[J].ACS Appl.Mater.Interfaces,2014,6:22326-22333.

[13]王猛.LaF3:Eu,Tb熒光納米粉末的制備及其在手印顯現(xiàn)中的應(yīng)用[J].中國(guó)刑警學(xué)院學(xué)報(bào),2015(2): 56-58.

[14]張振宇,鄒寧,齊寶坤,等.熒光光譜法檢驗(yàn)車輛上的潤(rùn)滑油[J].中國(guó)刑警學(xué)院學(xué)報(bào),2004(1):55-56.

[15]劉麗,李勇,金勇鎰.熒光復(fù)合材料在手印顯現(xiàn)中的應(yīng)用研究[J].中國(guó)刑警學(xué)院學(xué)報(bào),2012(4):27-28.

[16]謝濤,林添春,王猛.納米發(fā)光材料在手印無(wú)損DNA顯現(xiàn)中的研究[J].中國(guó)刑警學(xué)院學(xué)報(bào),2015(3): 71-73.

[17]SYimin,Z Cheng,G Rui,et al.ARatiometric Fluorescent Chemodosimeter with Selective Recognition for Sulfite in Aqueous Solution [J].Journal of Organic Chemistry,2009,74(20):7943-7946.

[18]SYuan-qiang,W Pi,L Jing,et al.A fluorescent Turn-on Probe for Bisulfite Based on Hydrogen Bond-inhibited C=N isomerizationmechanism[J].Analyst,2012,137(15):3430-3433.

[19]J Chao,Y Zhang,H Wang,et al.Fluorescent Red GK asa Fluorescent Probe for Selective Detection of Bisulfite Anions [J].Sensors & Actuators B Chemical,2013,188(11):200 206.

[20]YChen,X Wang,XFYang,et al.Development of a Ratiometric Fluorescent Probe for Sulfite Based on a Coumarin-benzopyrylium Platform[J].Sensors&Actuators B:Chemical,2015(206):268-275.

[21]LJing,SYuan-qiang,H Yingying.Simultaneous Fluorescence Sensing of Cys and GSH from Different Emission Channels[J].Journal of the American Chemical Society,2014,136(2):574-577.

DF794.3

A

2095-7939(2016)01-0077-04

2015-11-25

2015年度遼寧省教育廳科技研究項(xiàng)目；2015年度中國(guó)刑事警察學(xué)院研究項(xiàng)目。

呂勇智（1990-），男，福建廈門人，中國(guó)刑事警察學(xué)院碩士研究生，主要從事刑事毒物、毒品分析檢驗(yàn)研究。

孟凡騫）