吳淵虬劉宗偉陶陸陽（蘇州大學 江蘇 蘇州 5007；常熟市公安局 江蘇 蘇州 5500）

網(wǎng)線接頭上脫落細胞采集方法對STR分型的影響

吳淵虬1劉宗偉2陶陸陽1
（1蘇州大學 江蘇 蘇州 215007；2常熟市公安局 江蘇 蘇州 215500）

探究網(wǎng)線接頭上的脫落細胞進行STR分型的可行性及脫落細胞不同的采集方法對STR分型結(jié)果的影響。通過比較發(fā)現(xiàn)剪取法采集網(wǎng)線接頭上的脫落細胞進行STR分型37例中檢出12個以上基因座達33例，顯著高于擦拭法，得出剪取法采集網(wǎng)線接頭上的脫落細胞進行STR分型效果更優(yōu)的結(jié)論。

法醫(yī)物證 網(wǎng)線接頭 脫落細胞 STR分型

接觸性DNA檢材是法醫(yī)學DNA檢驗的熱點和難點問題之一，這類檢材所含有的DNA樣本屬于低拷貝(Low Copy Number，LCN)模板，即DNA含量小于100pg的樣本。接觸性DNA檢材不僅存在于犯罪現(xiàn)場，往往也會存在于犯罪嫌疑人或被害對象的用具、衣物等客體上。隨著犯罪嫌疑人警惕性的不斷提高，一些明顯可見的生物物證（如血痕、毛發(fā)、精斑等）常被犯罪嫌疑人銷毀破壞，但來自人體粘膜或皮膚表面的脫落細胞由于微小痕量卻常被忽略，如遺留在口罩、飲料瓶、煙蒂上的口腔上皮細胞；遺留在刀柄、指紋、手套上的體表脫落細胞，對于這類生物物證，一旦能夠成功檢驗分析出其中的DNA樣本，就能為案件的偵破提供有效的科學證據(jù)[1]。本文以現(xiàn)場遺留的網(wǎng)線接頭作為檢材，通過擦拭法和切割法兩種方法提取網(wǎng)線接頭上的微量脫落上皮細胞并進行STR分型，探究網(wǎng)線接頭提取DNA檢材的可行性并篩選出高檢出率的提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料

2012 年以來本實驗室受理案件中的網(wǎng)線接頭70份，其中33份由現(xiàn)場勘查人員采用擦拭法采集網(wǎng)線接頭上的脫落細胞，標記為檢材I；37份由本實驗室人員采用剪取法采集網(wǎng)線接頭上的脫落細胞，標記為檢材II。

1.2 主要設(shè)備和試劑

GeneAmp PCR System 9700型定量PCR儀，ABI3500XL型熒光分析儀，GeneMapper ID-X分析軟件，AmpFISTR Identifiler Plus（AB）試劑盒，D盾超敏DNA提取試劑盒。

1.3 實驗方法和樣品的準備

1.3.1 檢材采集方法

（1）擦拭法：取一根干棉簽吸取適量去離子水，在網(wǎng)線接頭上的水晶頭彈片表面來回擦拭一次，再取第二根干棉簽擦拭水晶頭彈片表面，將兩根棉簽置于D盾超敏DNA提取試劑盒1.5mL離心管的套管內(nèi)；再以同樣方法擦拭網(wǎng)線接頭表面的其余部位，將棉簽置于上述離心管套管內(nèi)。

（2）剪取法：用剪刀將網(wǎng)線接頭上的水晶頭彈片剪下，置于D盾超敏DNA提取試劑盒1.5mL離心管底部，在離心管內(nèi)加置離心套管；取一根干棉簽吸取適量去離子水，在網(wǎng)線接頭表面的其余部位往復擦拭一次，再取第二根干棉簽擦拭網(wǎng)線接頭表面的其余部位，將兩根棉簽置于上述離心管套管內(nèi)。

1.3.2 改良硅珠法DNA提取和純化步驟

（1）檢材I的DNA提取和純化：①在放有棉簽的離心套管內(nèi)加入180μL裂解液，99℃裂解5分鐘；②8000g離心2分鐘，棄套管，加入吸附液1000μL，硅珠16μL，蝸旋后靜置15分鐘；③8000g離心1分鐘，棄上清，加入800μL漂洗液，充分混勻后8000g離心1分鐘，棄上清；④置于56℃金屬浴上烘干沉淀物，后加入20μL洗脫液，充分混勻后置于56℃金屬浴上洗脫15分鐘；⑤16000g離心2分鐘，取上清液進行PCR。

（2）檢材II的DNA提取和純化：①在放有棉簽的離心套管內(nèi)加入180μL裂解液，99℃裂解5分鐘；②8000g離心2分鐘，棄套管，試管在99℃二次裂解5分鐘；③8000g離心2分鐘，轉(zhuǎn)移上清液至另一試管內(nèi)，加入吸附液1000μL，硅珠16μL，蝸旋后靜置15分鐘；④8000g離心1分鐘，棄上清，加入800μL漂洗液，充分混勻后8000g離心1分鐘，棄上清；⑤置于56℃金屬浴上烘干沉淀物，后加入20μL洗脫液，充分混勻后置于56℃金屬浴上洗脫15分鐘；⑥16000g離心2分鐘，取上清液進行PCR。

1.4 PCR擴增反應

反應體系為15μL，包括mix 6μL，prime set 3μL，模板DNA6μL。熱循環(huán)條件為95℃11分鐘、94℃20秒、59℃3分鐘，共30個循環(huán)，最后60℃延伸10分鐘。

1.5 PCR擴增產(chǎn)物分析

PCR擴增產(chǎn)物應用ABI3500XL型熒光分析儀進行毛細管電泳，用GeneMapper ID-X軟件分析STR基因型。

2 結(jié)果

2012 年以來涉案電腦附件網(wǎng)線接頭的檢測結(jié)果統(tǒng)計如下表所示。表中結(jié)果顯示，33例擦拭法采集網(wǎng)線接頭上的脫落細胞進行STR分型檢出12個以上基因座22例，其中單一個體12例，混合個體10例，檢出12個以下基因座11例；37例剪取法采集網(wǎng)線接頭上的脫落細胞進行STR分型檢出12個以上基因座32例，其中單一個體21例，混合個體11例，檢出12個以下基因座5例。通過對比實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)剪取法采集網(wǎng)線接頭上的脫落細胞進行STR分型效果更優(yōu)。

表 涉案檢材相關(guān)統(tǒng)計數(shù)據(jù)

3 討論

相關(guān)實驗證明人體只需接觸物體表面5秒鐘就可能有上皮脫落細胞遺留在物體的表面[2,3]。手是犯罪嫌疑人在作案過程中接觸現(xiàn)場物體最多的部位，在其接觸過的物體表面很可能會遺留下手指上的脫落細胞。正常情況下，人體皮膚表面的脫落細胞多數(shù)為已經(jīng)角質(zhì)化的細胞，這是由于人體皮膚表面的細胞會隨著新陳代謝不斷更新，為了抵御外界的各種刺激逐漸移動、分化，并最終成為角質(zhì)細胞，而角質(zhì)細胞的細胞核已經(jīng)解體，無法從中獲得足夠多的DNA樣本進行STR分型，但在某些情況下，如與物體摩擦或皮膚出汗時，會留下較多的有核上皮細胞[4,5]。犯罪嫌疑人在盜竊電腦過程中將網(wǎng)線接頭拔出時手指必定會按壓網(wǎng)線接頭上的水晶頭彈片，手指必定會與網(wǎng)線接頭發(fā)生一定摩擦，因此在網(wǎng)線接頭上留下的上皮脫落細胞中有一部分是新生的有核細胞，從這些新生的有核細胞中就能夠提取到未降解的細胞核DNA，再運用STR分型檢測就能為案件的偵破提供關(guān)鍵線索。但如何把網(wǎng)線接頭上的DNA盡可能地轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)是提高STR檢出率的關(guān)鍵所在。

接觸性DNA檢材所含有的DNA樣本屬于低拷貝模板，需要獲得足夠多的DNA樣本才能進行有效的STR分型[6]。因此，在提取和轉(zhuǎn)移接觸性DNA檢材的過程中應盡量多采集載體表面的脫落細胞，以求獲取到足夠多的DNA樣本進行STR分型檢測。一般情況下，當DNA STR分型檢出的位點大于或等于12個基因座時代表檢測效果較好，可以進行個體識別。

橫向分析上表中的結(jié)果顯示，并不是所有的樣本都能得到明確的STR分型。樣本能否得到明確分型關(guān)鍵取決于以下兩方面：一方面是犯罪嫌疑人在作案過程中是否戴手套；另一方面是犯罪嫌疑人接觸網(wǎng)線接頭時間的長短。同時，犯罪嫌疑人在盜竊過程中的主要接觸部位水晶頭彈片面積小，網(wǎng)線接頭上留有的脫落上皮細胞含量非常低，屬于極微量檢材，并且不同的犯罪嫌疑人的生理特征及在作案過程中的行為習慣是不同的，這就導致他們遺留在網(wǎng)線接頭上的脫落細胞在數(shù)量和成分上會有所不同，而同一犯罪嫌疑人在不同的生理狀態(tài)和外部環(huán)境下，體表脫落細胞的構(gòu)成也是不同的，這就導致了實驗中有些樣本不能得到明確的STR分型。

縱向分析上表中的結(jié)果顯示，剪取法采集網(wǎng)線接頭上的脫落細胞進行STR分型檢出12個以上基因座例數(shù)高于擦拭法，其中單一個體例數(shù)前者也遠遠多于后者。這是由于網(wǎng)線接頭的表面積較小，特別是水晶頭彈片，限制了反復擦拭的幅度，并且擦拭載體轉(zhuǎn)移也會損失部分脫落細胞，增加了上皮脫落細胞獲取的難度，因此，利用擦拭法擦拭網(wǎng)線接頭的表面不能有效地獲取到足夠多的上皮脫落細胞用于STR分型[7-9]，這樣就降低了DNA STR檢測的檢出率。而通過觀察網(wǎng)線接頭的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，犯罪嫌疑人在盜竊電腦過程中用手拔出網(wǎng)線接頭時手指必定會按壓到網(wǎng)線接頭上的水晶頭彈片，因而本實驗室人員采用的剪取法是將網(wǎng)線接頭上的水晶頭彈片剪下放入試管底部用于二次裂解，這是區(qū)別于擦拭法的關(guān)鍵步驟，這一步驟能將水晶頭彈片上的脫落細胞完全轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，避免了擦拭法不能完全獲取到水晶頭彈片上脫落細胞的弊端，大大增加了可用于STR分型的脫落細胞數(shù)量，而之后再反復擦拭網(wǎng)線接頭表面的其余部分，降低了上皮脫落細胞獲取的難度，能從網(wǎng)線接頭上獲取到盡可能多的上皮脫落細胞，并且水晶頭彈片大多為塑料材質(zhì)，屬于非滲透性檢材，二次裂解的效果好，有效地提高了DNA STR檢測的檢出率。

總之，用針對性的方法獲取網(wǎng)線接頭上的脫落上皮細胞及在嚴格控制污染的條件下，網(wǎng)線接頭上附著的脫落細胞可作為一種法醫(yī)生物學檢材，其DNA STR分型結(jié)果能為案件偵破提供指導作用，而采用剪取法采集網(wǎng)線接頭上的脫落細胞進行STR分型效果更優(yōu)。參考文獻：

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DF795.2

A

2095-7939(2016)01-0071-03

2014-11-25

吳淵虬（1988-），男，江蘇常熟人，江蘇省常熟市公安局刑警大隊DNA實驗室助理工程師，蘇州大學碩士研究生，主要從事法醫(yī)物證學研究。

孟凡騫）