周新虎，陳　翔，嚴(yán)啟梅，楊　勇，李　喆，姜　勇，戴　源，譚洪娣，宋　寶（江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800）

?

核苷功能菌腺苷超聲提取工藝優(yōu)化

周新虎，陳翔，嚴(yán)啟梅，楊勇，李喆，姜勇，戴源，譚洪娣，宋寶
（江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800）

摘要：研究超聲波水提法提取核苷功能菌腺苷的最佳工藝。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，采用高效液相色譜法測(cè)定腺苷含量，考察料液比、超聲提取溫度、超聲提取時(shí)間和超聲功率對(duì)核苷功能菌腺苷含量的影響。得出影響核苷功能菌腺苷提取效果的先后次序?yàn)椋禾崛r(shí)間＞料液比＞超聲功率＞提取溫度。最佳提取工藝條件為料液比1/150 g/mL、提取溫度55℃、提取時(shí)間20 min、超聲功率350 W。該工藝條件下，核苷功能菌菌絲體中腺苷含量高達(dá)435.58 mg/100 g。

關(guān)鍵詞：微生物；核苷功能菌；腺苷；超聲提取法；正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

核苷功能菌，泛指能夠代謝生成核苷及其類似物的一類微生物，據(jù)研究，核苷功能菌可以代謝生成核苷及其類似物、多糖類、D-甘露醇等成分，其中腺苷是核苷功能菌主要活性成分，也是調(diào)節(jié)睡眠的內(nèi)穩(wěn)態(tài)因子之一，對(duì)人體代謝和生理功能起到重要調(diào)節(jié)作用[1-3]。

目前，常用高效液相色譜法來檢測(cè)腺苷含量，但對(duì)于核苷功能菌中腺苷的前處理方法，沒有系統(tǒng)性的研究報(bào)道。據(jù)相關(guān)研究，不同提取方法對(duì)腺苷的提取，超聲法的效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于回流法和振蕩法；不同提取溶劑（甲醇、乙醇、水）對(duì)腺苷提取效果的影響，采用純水提取時(shí)腺苷的提取效果最好，雜質(zhì)干擾少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合已有的研究結(jié)果，采取超聲提取法，以水為提取溶劑，從料液比、提取溫度、提取時(shí)間和超聲功率4個(gè)因素優(yōu)化核苷功能菌中腺苷的前處理，為快速準(zhǔn)確測(cè)定核苷功能菌中的腺苷含量提供理論參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)菌種：本公司技術(shù)中心功能微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2耗材及儀器

實(shí)驗(yàn)耗材：腺苷標(biāo)準(zhǔn)品，純度100 mg/L，sigma試劑公司生產(chǎn)；磷酸二氫鉀（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；甲醛（色譜純），德國merck公司提供；等。

實(shí)驗(yàn)儀器：真空冷凍干燥機(jī)，F(xiàn)D-1C-50型，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；冰箱，BCD-649WE型，青島海爾股份有限公司；臺(tái)式低速離心機(jī)，AXTD5A型，鹽城市安信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；電子天平，AL204型，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；高效液相色譜，HPLC-e2695，美國waters高效液相色譜儀；二極管陣列檢測(cè)器，島津公司；一次性使用無菌注射器帶針，圣光醫(yī)用制品有限公司；wondaDisc水系針頭濾器MCE25 mm×0.45 μm，島津技邇（上海）商貿(mào)有限公司；Millpore超純水系統(tǒng)；KH-500DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1菌絲體預(yù)處理[4]

將液體深層發(fā)酵獲得的核苷功能菌菌絲體經(jīng)真空冷凍干燥后，粉碎，過80目篩，封口袋保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2標(biāo)樣溶液的制備

準(zhǔn)確量取一定體積的100 mg/L的腺苷置于10 mL容量瓶，用超純水溶液溶解定容，分別配制成質(zhì)量濃度（mg/L）為5、10、15、20、25、30、35、40的腺苷溶液，作為標(biāo)樣溶液。

1.3.3菌絲體中腺苷的超聲提取方法

準(zhǔn)確稱取一定量的已預(yù)處理的菌絲體粉末于50 mL容量瓶中，加入45 mL超純水，按試驗(yàn)設(shè)定條件超聲提取腺苷，用超純水定容（腺苷粗提液），振蕩搖勻，以4000 r/min離心5 min，再經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，所得濾液即為菌絲體中腺苷提取液，進(jìn)行HPLC分析。

1.3.4腺苷的測(cè)定方法[5-6]

利用HPLC法測(cè)定核苷功能菌菌絲體中腺苷的含有量。流動(dòng)相為pH6.5的磷酸鹽緩沖液-甲醇(體積比85∶15)；色譜柱為C18，體積流量1 mL/min，檢測(cè)波長260 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.5菌絲體中腺苷提取率的計(jì)算

腺苷提取率（mg/100g）=腺苷含量(mg/L)×腺苷粗提液體積（mL）×1000/菌絲體質(zhì)量(g)×100。

1.3.6單因素提取試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別以不同的料液比、提取溫度、提取時(shí)間、超聲功率作為單因素試驗(yàn)影響因子，考察各單因素對(duì)核苷功能菌菌絲體中腺苷含量的影響。

1.3.7超聲提取工藝正交試驗(yàn)

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇料液比、提取溫度、提取時(shí)間、超聲功率4個(gè)因素，各取3個(gè)水平，采用L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，見表1。

表1 超聲提取腺苷正交試驗(yàn)因子及水平

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1料液比對(duì)腺苷提取效果的影響

按照不同的料液比（g/mL）1/50、1/100、1/150、1/200、1/250，稱取適宜的核苷功能菌絲體粉末于50 mL容量瓶中，加入45 mL超純水搖勻，于50℃、350 W條件下超聲20 min，冷卻，用超純水定容至刻度，振蕩搖勻，以4000 r/min離心5 min，再經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，所得濾液進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果見圖1。

圖1 料液比對(duì)腺苷提取效果的影響

由圖1結(jié)果表明，不同料液比對(duì)腺苷的提取效果有影響，料液比大，提取效果好。當(dāng)料液比達(dá)到1/150 g/mL時(shí)提取效率達(dá)到最大值，為402.50 mg/100 g，當(dāng)料液比為1/200 g/mL時(shí)腺苷含量為393 mg/100 g，與料液比1/150 g/mL相比，降低2.36 %，考慮節(jié)約提取溶劑，降低提取成本，建議選擇料液比1/150 g/mL。

2.1.2提取溫度對(duì)腺苷提取效果的影響

按照1/150的料液比（g/mL）稱取適宜的核苷功能菌菌絲體粉末于50 mL容量瓶中，加入45 mL超純水搖勻，分別于溫度45℃、50℃、55℃、60℃、65℃，超聲功率為350 W條件下超聲20 min，冷卻，用超純水定容至刻度，振蕩搖勻，以4000 r/min離心5 min，再經(jīng)0. 45 μm微孔濾膜過濾，所得濾液進(jìn)行HPLC分析。

圖2 提取溫度對(duì)腺苷提取效果的影響

溫度對(duì)超聲波提取核苷功能菌絲體粉中腺苷的影響結(jié)果見圖2。提高溫度有利于提取腺苷，但溫度過高會(huì)使腺苷提取效果變差，腺苷的熱穩(wěn)定性也隨之變差，因此過高的溫度可能會(huì)影響腺苷的提取效果。從圖2可以看出，超聲提取溫度為55℃時(shí)，腺苷含量達(dá)到最大值422.66 mg/100 g，溫度繼續(xù)升高時(shí)，腺苷含量出現(xiàn)下降趨勢(shì)，因此超聲最佳提取溫度為55℃。張娜等[7]研究指出，隨著超聲提取溫度的升高，白囊耙齒菌絲體中腺苷提取率先升高后降低，本研究結(jié)論與其相似。

2.1.3提取時(shí)間對(duì)腺苷提取效果的影響（圖3）

按照1/150的料液比（g/mL）稱取適宜的核苷功能菌菌絲體粉末于50 mL容量瓶中，加入45 mL超純水搖勻，以50℃、350 W條件下分別超聲10 min、15 min、20 min、25 min、30 min，冷卻，用超純水定容至刻度，振蕩搖勻，以4000 r/min離心5 min，再經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，所得濾液進(jìn)行HPLC分析。

圖3 提取時(shí)間對(duì)腺苷提取效果的影響

超聲提取時(shí)間越長，核苷功能菌絲體細(xì)胞破碎越充分，細(xì)胞內(nèi)含物質(zhì)滲出越多，腺苷提取液中水溶性成分含量增加，達(dá)到一定時(shí)間，絕大多數(shù)水溶性成分即可全部提出；但隨著時(shí)間的延長，不但細(xì)胞破碎率不會(huì)提高，甚至?xí)?duì)細(xì)胞中生物分子有破壞作用，增加了提取液中干擾物質(zhì)的量，加大了檢測(cè)分析的難度[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著提取時(shí)間的延長，腺苷的含量明顯增加。當(dāng)提取時(shí)間為20 min時(shí)，腺苷含量達(dá)到最高值，超過25 min后，腺苷含量降低。為提高腺苷提取效率，建議選擇超聲提取20 min為最佳時(shí)間。

2.1.4超聲功率對(duì)腺苷提取效果的影響

按照1/150的料液比（g/mL）稱取適宜的核苷功能菌絲體粉末于50 mL容量瓶中，加入45 mL超純水搖勻，于溫度55℃、不同超聲功率（W）250、300、350、400、450條件下超聲20 min，冷卻，用超純水定容至刻度，振蕩搖勻，以4000 r/min離心5 min，再經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，所得濾液進(jìn)行HPLC分析（見圖4）。

圖4 超聲功率對(duì)腺苷提取效果的影響

由圖4可知，當(dāng)超聲功率在200～400 W范圍內(nèi)，隨著超聲功率的增大，腺苷含量先增加后降低。當(dāng)超聲功率為350 W時(shí)，腺苷含量達(dá)到最大值423.89 mg/100 g；當(dāng)超聲功率為400 W時(shí)，腺苷含量反而降低，可能是由于超聲波的強(qiáng)烈空化效應(yīng)使腺苷結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致提取率降低。因此，超聲功率為350 W時(shí)，較有利于核苷功能菌絲體中腺苷的提取。

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果（表2）

表2 正交試驗(yàn)及結(jié)果

由表2中R值可知，影響核苷功能菌腺苷含量的先后順序是C＞A＞D＞B，即最重要的因素為超聲作用時(shí)間，其次是料液比，再次是超聲功率，最后是提取溫度。最佳組合為A2B2C3D1，即提取工藝參數(shù)為料液比1/150 g/mL、提取溫度55℃、提取時(shí)間25 min、超聲功率300 W。將此結(jié)果與單因素試驗(yàn)篩選出的最佳條件組合分別進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

由表3驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果可知，核苷功能菌腺苷超聲提取的最佳工藝組合為A2B2C2D2，即料液比1/150 g/mL、提取溫度55℃、提取時(shí)間20 min、超聲功率350 W，得到核苷功能菌腺苷最高值435.58 mg/100 g，RSD為1.23 %。

2.3超聲提取法與常規(guī)提取法的比較

準(zhǔn)確稱取一定量預(yù)處理后的核苷功能菌粉末，固定料液比、提取溫度（室溫浸提除外），適當(dāng)延長室溫浸提和熱浸漬法的提取時(shí)間，測(cè)定3種提取法核苷功能菌腺苷的含量，試驗(yàn)條件及結(jié)果見表4。

表4 超聲提取法與常規(guī)提取法的比較

由表4可知，超聲提取法較常規(guī)提取法有較大優(yōu)勢(shì)，腺苷含量分別高于常規(guī)提取法室溫浸提法的157.8 %，熱浸提取法的9.18 %，而且縮短了整個(gè)工藝的提取時(shí)間，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考依據(jù)。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，采用超聲法提取核苷功能菌腺苷含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，影響超聲提取核苷功能菌腺苷含量的4個(gè)因素先后順序?yàn)槌曁崛r(shí)間＞料液比＞超聲功率＞提取溫度。得到的最佳工藝參數(shù)為料液比1/150 g/mL、提取溫度55℃、提取時(shí)間20 min、超聲功率350 W。在該條件下核苷功能菌腺苷含量435.58 mg/100 g，RSD為1.23 %。與常規(guī)提取方法相比，超聲提取法簡單易行、效率高、提取時(shí)間短，是一種提取核苷功能菌腺苷的有效途徑，具有推廣應(yīng)用的價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1]張?jiān)?錢正明,陳肖家. HPLC法同時(shí)測(cè)定補(bǔ)益中藥中尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷的含量[J].藥物分析雜志,2010, 30(1)：33-36.

[2]江元翔,高淑紅,陳長華.響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化腺苷發(fā)酵培養(yǎng)基[J].華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2005,31(3)：309-313.

[3] Cui F L, Wang J L, Cui Y R, et al. Investigation of interaction between human serumalbumin and N6-(2-hydroxyethyl)-adenosine by fuorescence spectroscopy and molecular modelling[J]. Luminescence 2007,22：546-553.

[4]張娜,郭嬌,季文彬,等.響應(yīng)面法優(yōu)化白囊耙齒菌中腺苷的超聲法提取工藝[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2011,42(2)：100-103.

[5]張命龍,焦春偉,謝意珍,等.蝙蝠蛾擬青霉液體發(fā)酵工藝優(yōu)化及菌絲體腺苷含量的檢測(cè)[J].菌物學(xué)報(bào),2016,35(1)：1-14.

[6]張博,楊黎彬,李金娟.高效液相色譜法測(cè)定擬青霉中活性成分腺苷的含量[J].今日藥學(xué),2011,21(2)：25-26.

[7]張娜,周衛(wèi),王文溪,等.響應(yīng)面法優(yōu)化白囊耙齒菌中腺苷的提取工藝[J].中國生化藥物雜志,2011,32(5)：370-373.

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Adenosine from Nucleoside Functional Bacteria

ZHOU Xinhu, CHEN Xiang, YAN Qimei, YANG Yong, LI Zhe, JIANG Yong, DAI Yuan, TAN Hongdi and SONG Bao
(Yanghe Distillery Co.Ltd., Suqian, Jiangsu 223800, China)

Abstract:The ultrasonic-assisted extraction conditions of adenosine from nucleoside functional bacteria were optimized by single factor test and orthogonal experiments. Adenosine content was measured by HPLC. The effects of solid-liquid ratio, extraction temperature, ultrasonic extraction time and ultrasonic power on adenosine content were investigated. The factors influencing adenosine extraction ranked in decreasing sequence as follows: extraction time>solid- liquid ratio>ultrasonic power>extraction temperature. The optimum technical parameters were summed up as follows: solid-liquid ratio was 1/150 g/mL, extraction temperature at 55℃, ultrasonic extraction time was 20 min, and ultrasonic power was 350 W. Under above conditions, the content of the extracted adenosine from nucleoside functional bacteria reached up to 435.58 mg/100 g.

Key words:microbe; nucleoside functional bacteria; adenosine; ultrasonic-assisted extraction; orthogonal experiments design

作者簡介：周新虎（1962-），男，江蘇宿遷人，漢族，碩士，高級(jí)工程師，江蘇洋河酒廠股份有限公司副總裁、總工程師，白酒國家評(píng)委，中國首席品酒師、中國評(píng)酒大師，曾獲全國五一勞動(dòng)獎(jiǎng)?wù)拢K省突出貢獻(xiàn)專家等榮譽(yù)稱號(hào)。

收稿日期：2015-12-16

DOI：10.13746/j.njkj.2015468

中圖分類號(hào)：TS262.3；Q93-3；TS261.1；TS261.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016)04-0070-04

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-02-02；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160202.1542.005.html。